微生物培養(yǎng)與分離方法：細(xì)菌的接種和培養(yǎng)及其生長特性

專注水產(chǎn)適用技術(shù)，奉獻(xiàn)實(shí)用養(yǎng)魚信息！

大多數(shù)細(xì)菌均可以通過人工方法培養(yǎng)，而衣原體和病毒的分離培養(yǎng)往往需要活組織、雞胚、特殊細(xì)胞株及動(dòng)物接種。只有將微生物培養(yǎng)出來才能對(duì)它進(jìn)行研究、鑒定和應(yīng)用，對(duì)于魚類細(xì)菌性疾病的認(rèn)定很有幫助。

一、接種與分離方法

根據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì)、培養(yǎng)目的和所用培養(yǎng)基的種類，采用不同的接種方法。

1．平板劃線分離培養(yǎng)法

對(duì)混有多種細(xì)菌的臨床標(biāo)本，采用劃線分離和培養(yǎng)，使原來混雜在一起的細(xì)菌沿劃線在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個(gè)菌落，以獲得純種。臨床送檢的標(biāo)本如痰、咽試子、泌尿生殖道的分泌物和糞便等細(xì)菌檢驗(yàn)均需要借助瓊脂平板劃線分離目的菌。平板劃線分離法通常有兩種方法：

（1）分區(qū)劃線分離法：此法常用于含菌量較多的標(biāo)本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便或混合細(xì)菌的分離。先用接種環(huán)挑取標(biāo)本涂布于瓊脂平板1區(qū)（占培養(yǎng)基總面積的?）并作數(shù)條劃線，再于2、3、4區(qū)依次劃線。每劃完一個(gè)區(qū)域，均將接種環(huán)燒灼滅菌1次，冷后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均與上一區(qū)域的劃線交接1~3次。一個(gè)成功分區(qū)劃線的平板，培養(yǎng)后分別觀察1區(qū)形成菌苔，2區(qū)菌落連成線，3區(qū)和4區(qū)可分離到單個(gè)菌落。

（2）連續(xù)劃線分離法：此法常用于含菌量不多的標(biāo)本或培養(yǎng)物中的細(xì)菌分離培養(yǎng)。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹，然后再用接種環(huán)或拭子在平板表面曲線連續(xù)劃線接種，直至劃滿瓊脂平板表面。

瓊脂斜面接種法

主要用于菌落的移種，以獲得純種進(jìn)行鑒定和保存菌種等。用接種環(huán)（針）挑取單個(gè)菌落或培養(yǎng)物，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線，然后再從底部沿直線向上曲折連續(xù)劃線，直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養(yǎng)基斜面接種，用接種針挑取待鑒定細(xì)菌的菌落，從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。

3．穿刺接種法

此法多用于半固體培養(yǎng)基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養(yǎng)基接種，半固體培養(yǎng)基的穿刺接種可用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。接種時(shí)用接種針挑取菌落，由培養(yǎng)基中央垂直刺入至距管底0.4cm處，再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養(yǎng)基，穿刺高層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。

4．液體培養(yǎng)基接種法

用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等的接種。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物（以試管直立后液體淹沒接種物為準(zhǔn)）。此接種法應(yīng)避免接種環(huán)與液體過多接觸，更不應(yīng)在液體中混勻、攪拌，以免形成氣溶膠，造成實(shí)驗(yàn)室污染。

5．傾注平板法

本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標(biāo)本中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。取純培養(yǎng)物的稀釋或原標(biāo)本1ml至無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15~20ml傾注入該無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混勻，待凝固后置37℃培養(yǎng)，長出菌落后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以求出每毫升標(biāo)本中所含菌數(shù)。先數(shù)6個(gè)方格（每格為1cm2）中菌落數(shù)，求出每格的平均菌落數(shù)，并算出平皿直徑，然后按下列公式計(jì)數(shù)，求出每毫升標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)。

全平板菌落數(shù)=每方格的平均菌落數(shù)×лr2

每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)=全平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)

6．涂布接種法

本法多用于紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的細(xì)菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養(yǎng)基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養(yǎng)，本法經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)菌形成菌苔。

二、細(xì)菌的培養(yǎng)方法

根據(jù)不同的標(biāo)本及不同的培養(yǎng)目的，可選用不同的培養(yǎng)方法。通常把細(xì)菌的培養(yǎng)方法分為需氧培養(yǎng)、二氧化碳培養(yǎng)、微需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)四種。

1．需氧培養(yǎng)

是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng)，將已接種好的平板、斜面、液體培養(yǎng)基等在空氣中置35℃孵育箱內(nèi)孵育18~24h，無特殊要求的細(xì)菌均可生長。少數(shù)生長緩慢的細(xì)菌需要培養(yǎng)3-7d甚至1個(gè)月才能生長。為使孵育箱內(nèi)保持一定的濕度，可在其內(nèi)放置一杯水。對(duì)培養(yǎng)時(shí)間較長的培養(yǎng)基，接種后應(yīng)將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固，以防培養(yǎng)基干裂。

2．二氧化碳培養(yǎng)

某些細(xì)菌，如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的培養(yǎng)，特別是在初次分離時(shí)，須在5%~10 %二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)才能生長。常用的培養(yǎng)法如下。

（1）二氧化碳培養(yǎng)箱法：二氧化碳孵箱能自動(dòng)調(diào)節(jié)二氧化碳的含量、溫度和濕度，培養(yǎng)物置于孵育箱內(nèi)閣，孵育一定時(shí)間后可直接觀察生長結(jié)果。

（2）燭缸培養(yǎng)法：取有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器，將接種好的培養(yǎng)基放入缸內(nèi)，點(diǎn)燃蠟燭后放在缸內(nèi)稍高于培養(yǎng)物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。因缸內(nèi)蠟燭燃燒氧逐漸減少，數(shù)分鐘后蠟燭自行熄滅，此時(shí)容器內(nèi)二氧化碳含量約占5%~10%。將缸置于35℃普通孵育箱內(nèi)孵育。

（3）氣袋法：選用無毒透明的塑料袋，將已接種標(biāo)本的培養(yǎng)皿放入袋內(nèi)，盡量祛除袋內(nèi)空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態(tài)，執(zhí)斷袋內(nèi)已置的二氧化碳產(chǎn)氣管（安瓿）產(chǎn)生二氧化碳，數(shù)分鐘內(nèi)就可達(dá)到需要的二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境，置于35℃孵育箱內(nèi)孵育。

（4）化學(xué)法：常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例，分別置容器內(nèi)，連同容器置于玻璃缸內(nèi)，蓋緊密封，傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。于35℃孵育箱內(nèi)孵育。

3．微需氧培養(yǎng)

微需氧菌培養(yǎng)在大氣中及絕對(duì)無氧環(huán)境中均不能生長，在含有5%-6% 氧氣，5%-10%二氧化碳和85%氮?dú)獾臍怏w環(huán)境中才可生長，將標(biāo)本接種到培養(yǎng)基上，置于上述氣體環(huán)境中，35℃進(jìn)行培養(yǎng)即微需氧培養(yǎng)法。

4．厭氧培養(yǎng)

厭氧菌對(duì)氧敏感，培養(yǎng)過程中需造成低氧化還原電勢(shì)的厭氧環(huán)境。厭氧培養(yǎng)常用的方法有：物理法、化學(xué)法、生物法。如厭氧罐培養(yǎng)法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。

三、細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長特性

1．固體培養(yǎng)基

標(biāo)本或液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基表面后，單個(gè)細(xì)菌經(jīng)分裂繁殖可形成一個(gè)肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落（colony）。

(1)菌落的形態(tài)特征：大小、形狀（露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)則等）、突起或扁平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。據(jù)細(xì)菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型：

①光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊，新分離的細(xì)菌大多呈光滑型菌落。

②粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細(xì)菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質(zhì)形成。R型細(xì)菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型細(xì)菌弱。但也有少數(shù)細(xì)菌新分離的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結(jié)核分枝菌等。

③粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細(xì)菌、結(jié)核桿菌等。

(2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。

①α溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)1~2mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；

②β溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個(gè)完全清晰透明的溶血環(huán)，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞完全溶解所致；

③γ溶血：即不溶血，菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，紅細(xì)胞沒有溶解或缺損。

(3)色素：有些細(xì)菌產(chǎn)生水溶性色素，使菌落和周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。

(4)氣味：某些細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長繁殖后可產(chǎn)生特殊氣味(頭條號(hào)@漁人劉文俊)，如銅綠假單胞菌（生姜?dú)馕叮?、變形桿菌（巧克力燒焦的臭味）、厭氧梭菌（腐敗的惡臭味）、白色假絲酵母菌（酵母味）和放線菌（泥土味）等。

2．液體培養(yǎng)基

細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中有3種生長現(xiàn)象：大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基生長繁殖后呈均勻混濁；少數(shù)鏈狀排列的細(xì)菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長，常形成菌膜。

3．半固體培養(yǎng)基

半固體培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)，有鞭毛的細(xì)菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細(xì)菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿刺線兩邊的培養(yǎng)基仍然澄清透明，為動(dòng)力試驗(yàn)陰性。

水產(chǎn)實(shí)踐人士，共謀漁業(yè)繁榮！更多精彩內(nèi)容敬請(qǐng)關(guān)注頭條號(hào)@漁人劉文俊，本文原創(chuàng)如需轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處，如有不同見解或者內(nèi)容補(bǔ)充請(qǐng)私信或留言或評(píng)論分享！#水產(chǎn)養(yǎng)殖#