牛蛙農(nóng)場(chǎng)將殺蛙真菌的致命游動(dòng)孢子，釋放到自然環(huán)境中的影響

牛蛙養(yǎng)殖和貿(mào)易實(shí)踐已經(jīng)確立，分布全球，具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但對(duì)生物多樣性保護(hù)構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)。牛蛙作為一種入侵物種對(duì)本地兩棲動(dòng)物種群產(chǎn)生負(fù)面影響外，在自然環(huán)境中傳播殺蛙真菌Batrachochytrium dendrobatidis方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

牛蛙對(duì)Bd有耐受性，這意味著它們可以攜帶高感染負(fù)荷而不會(huì)發(fā)展為壺菌病。為了測(cè)試牛蛙農(nóng)場(chǎng)作為多種和毒性壺菌基因型的水庫(kù)的潛力，我們量化了大約1，500只養(yǎng)殖牛蛙以及從農(nóng)場(chǎng)釋放到環(huán)境中的水中的Bd存在，患病率和感染負(fù)荷。

我們還描述了青蛙農(nóng)場(chǎng)內(nèi)的Bd基因型多樣性，方法是從數(shù)十只受感染的蝌蚪中分離出Bd。我們觀察到所有采樣豬場(chǎng)中感染Bd的個(gè)體，具有高患病率和高感染負(fù)荷，養(yǎng)殖場(chǎng)平均流出水量高，Bd游動(dòng)孢子濃度達(dá)到約50萬(wàn)個(gè)游動(dòng)孢子/升。

由于在耐受宿主中生長(zhǎng)時(shí)通常會(huì)選擇毒力病原體菌株，所以我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)測(cè)試，所以與從本地宿主物種分離的基因型相比，從牛蛙中分離的Bd基因型在原生無(wú)尾宿主中是否更具毒性，我們對(duì)來(lái)自兩個(gè)遺傳譜系的36個(gè)Bd分離株進(jìn)行了基因分型。

發(fā)現(xiàn)與從原生宿主分離的基因型相比，從牛蛙培養(yǎng)的Bd基因型在本地蟾蜍中表現(xiàn)出相似的毒力。我們的研究結(jié)果表明，牛蛙農(nóng)場(chǎng)可以擁有較高的Bd基因型多樣性和毒力，并可能導(dǎo)致毒力基因型在自然環(huán)境中的傳播。

需要在牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)施Bd監(jiān)測(cè)和緩解策略，以幫助保護(hù)本地兩棲動(dòng)物，牛蛙原產(chǎn)于北美東部，并在亞洲、中美洲和南美洲大規(guī)模養(yǎng)殖，供應(yīng)國(guó)際青蛙腿貿(mào)易，牛蛙養(yǎng)殖成為過(guò)度捕撈本地兩棲動(dòng)物物種的替代方案。

這種做法通過(guò)促進(jìn)生物入侵，繼續(xù)助長(zhǎng)當(dāng)前的全球兩棲動(dòng)物危機(jī)，牛蛙從農(nóng)場(chǎng)逃跑導(dǎo)致入侵牛蛙種群的建立，通過(guò)干擾聲學(xué)通信并危及本地?zé)o尾動(dòng)物的繁殖而對(duì)當(dāng)?shù)責(zé)o尾動(dòng)物產(chǎn)生負(fù)面影響，捕食本地兩棲動(dòng)物物種并爭(zhēng)奪資源，從而降低本地兩棲動(dòng)物種群的適應(yīng)性。

牛蛙在兩棲動(dòng)物壺菌病的動(dòng)態(tài)中也起著重要作用，壺菌病是一種由真菌Batrachochytrium dendrobatidis 引起的疾病，與全球兩棲動(dòng)物的下降有關(guān)。牛蛙是高度寬容的宿主，這意味著它們能夠承受高 Bd 感染負(fù)荷而不會(huì)發(fā)展為壺菌病。

牛蛙是感受態(tài)病原體宿主和國(guó)際病原體載體，已發(fā)現(xiàn)交易牛蛙攜帶多種Bd遺傳譜系，包括導(dǎo)致幾大洲兩棲動(dòng)物減少的侵入性高毒力全球大流行譜系。

以及來(lái)自地方性動(dòng)物譜系的基因型，由于與兩棲動(dòng)物宿主的長(zhǎng)期共同進(jìn)化，這些基因型的毒性往往較低，如BdASIA-2/BdBRAZIL報(bào)道的那樣， BdCAPE， BdCH29和BdASIA-111。

牛蛙-Bd相互作用和牛蛙養(yǎng)殖實(shí)踐的結(jié)合可能為壺菌病的爆發(fā)，和本地動(dòng)物群的減少創(chuàng)造理想的條件，牛蛙的高Bd耐受性表明，農(nóng)場(chǎng)可以作為特別致命的Bd基因型的宿主。

通過(guò)貿(mào)易引入的新型Bd基因型在原生宿主中也可能具有更高的毒力，而不是與它們共同進(jìn)化的地方性基因型。除此之外，不同Bd譜系的易位可能使先前分離的Bd基因型接觸，允許出現(xiàn)性雜交菌株，并可能產(chǎn)生比親本譜系更具毒性的雜交種除此之外。

牛蛙養(yǎng)殖中使用的水通常未經(jīng)處理就釋放到自然環(huán)境中，可能攜帶可能感染本地兩棲動(dòng)物物種的活Bd游動(dòng)孢子。牛蛙也以高密度養(yǎng)殖，為宿主之間的Bd傳播，雜交發(fā)育和選擇操作提供了理想的條件。

所以，牛蛙農(nóng)場(chǎng)可能會(huì)促進(jìn)致病性游動(dòng)孢子持續(xù)溢出到本地?zé)o尾生物群落和繁殖毒力Bd基因型，但以前的研究尚未量化牛蛙農(nóng)場(chǎng)的病原體流出或比較養(yǎng)殖和本地宿主物種在受控實(shí)驗(yàn)條件下攜帶的基因型的毒力。

牛蛙農(nóng)場(chǎng)評(píng)估

在養(yǎng)殖蝌蚪中觀察到的Bd患病率從5到48%不等。我們?cè)谒胸i場(chǎng)檢測(cè)到Bd幼魚，患病率達(dá)到100%，感染負(fù)荷高達(dá)71，029個(gè)動(dòng)物孢子基因組當(dāng)量，Bd患病率因兩棲動(dòng)物發(fā)育階段而異，幼魚的Bd患病率高于蝌蚪（Tukey P = 0.02），但成年蝌蚪則不然。

在考慮了誤報(bào)誤差的保守估計(jì)后，我們檢測(cè)到了相同的模式，在考慮假陰性誤差的保守估計(jì)時(shí)，Bd的患病率在整個(gè)生命階段相似，青少年的感染負(fù)荷高于成人（t = 6.55，df = 1，P < 0.001）。

研究表明，入侵牛蛙種群的Bd患病率很高，并可能有助于Bd通過(guò)國(guó)際食品貿(mào)易在全球傳播，我們?nèi)狈﹃P(guān)于青蛙養(yǎng)殖實(shí)踐如何促進(jìn)Bd傳播到附近本地宿主社區(qū)的信息，以及牛蛙農(nóng)場(chǎng)是否充當(dāng)高毒性Bd菌株的儲(chǔ)存庫(kù)。

牛蛙農(nóng)場(chǎng)不斷向周圍的自然環(huán)境釋放大量的Bd游動(dòng)孢子，青蛙圍欄中Bd游動(dòng)孢子的高濃度可能是由于受感染的青蛙圍欄中的水運(yùn)動(dòng)造成的，牛蛙農(nóng)場(chǎng)釋放的Bd游動(dòng)孢子不僅可以維持Bd在自然環(huán)境中的存在，還可以將病原體引入新的地點(diǎn)。

在養(yǎng)殖牛蛙中觀察到的高患病率和感染負(fù)荷，可以通過(guò)這些農(nóng)場(chǎng)中青蛙的高密度來(lái)解釋，這通過(guò)個(gè)體之間的直接接觸促進(jìn)了病原體的傳播或通過(guò)青蛙圍欄循環(huán)，在理想情況下，動(dòng)物的密度不應(yīng)超過(guò)每升水 20 只蝌蚪。

或每米 100 只幼蝌蚪/50 只成年蝌蚪，我們?cè)诓蓸愚r(nóng)場(chǎng)觀察到所有青蛙，生命階段的高牛蛙密度，圈養(yǎng)中的高宿主密度引起的應(yīng)激，可能會(huì)降低宿主免疫能力并增加病原體載量。

牛蛙蝌蚪的Bd患病率低于青少年和成年人，養(yǎng)殖牛蛙蝌蚪中Bd的患病率接近或超過(guò)巴西大西洋森林和熱帶草原野生蝌蚪的患病率，我們采樣農(nóng)場(chǎng)所在的生物群系，雖然目視檢查可以作為Bd診斷的代表。

在感染的早期階段可能無(wú)法觀察到口器去角化，我們?cè)谂Ｍ苻r(nóng)場(chǎng)檢測(cè)到的患病率可能被低估了，當(dāng)我們將誤差估計(jì)應(yīng)用于原始數(shù)據(jù)時(shí)，Bd患病率顯著增加，使我們的發(fā)現(xiàn)更加糟糕。

上述方法使用不同的物種和環(huán)境條件，并考慮具有動(dòng)物孢子基因組當(dāng)量的個(gè)體Bd≥0.1，而本研究≥1 ，這可能會(huì)產(chǎn)生高估的假陰性值，但是，考慮到這些數(shù)據(jù)的合法性，牛蛙蝌蚪的患病率可能高于觀察到的，所以我們最關(guān)心牛蛙農(nóng)場(chǎng)的高患病率。

我們認(rèn)為牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)的蝌蚪可能作為病原體的宿主發(fā)揮關(guān)鍵作用，保持水中高濃度的游動(dòng)孢子，促進(jìn)個(gè)體感染或再感染。

與蝌蚪相比，青少年的Bd患病率更高，與成年人相比，感染負(fù)荷更高。我們的研究結(jié)果證實(shí)了其他研究，顯示成人感染負(fù)荷低與成人相比，患病率、感染負(fù)荷和死亡率更高的青少年，在過(guò)程中，蝌蚪經(jīng)歷了幾個(gè)重塑免疫系統(tǒng)的生理過(guò)程，導(dǎo)致壓力。

從而增加對(duì)Bd感染的易感性。除此之外，新的個(gè)體可能更容易受到Bd感染的影響，這是皮膚角質(zhì)化發(fā)生的階段，提供了新的底物并使它們成為角質(zhì)造性病原體的極好宿主在野外，幼魚的高患病率和感染負(fù)荷可能導(dǎo)致Bd的更大傳播，因?yàn)檫@一發(fā)展階段與高分散率有關(guān)。

Bd在所有農(nóng)場(chǎng)和宿主生命階段的存在表明，這種病原體有可能通過(guò)對(duì)牛蛙的商業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生負(fù)面影響來(lái)經(jīng)濟(jì)地干擾ranaculture。雖然該物種可耐受 Bd 感染，先前的研究表明，牛蛙蝌蚪對(duì)感染的反應(yīng)表現(xiàn)出多種心臟改變。

可能會(huì)給發(fā)育中的動(dòng)物帶來(lái)高昂的能量成本，影響并可能降低生長(zhǎng)和變質(zhì)后的存活率。除此之外，蝌蚪的其他亞致死作用，如行為改變和進(jìn)食減少，乳糜感染也可能降低青蛙的免疫反應(yīng)，增加對(duì)其他感染的易感性。控制青蛙養(yǎng)殖場(chǎng)的壺菌感染可能會(huì)增加利潤(rùn)，因?yàn)樯a(chǎn)的青蛙的生長(zhǎng)和質(zhì)量得到提高。

除了作為病原體的宿主外，牛蛙還可能擁有Bd的高遺傳多樣性。在我們的重點(diǎn)農(nóng)場(chǎng)中存在兩個(gè)Bd譜系，BdGPL和BdASIA-2 / BdBRAZIL，即使在同一個(gè)蝌蚪中，也創(chuàng)造了很高的雜交潛力。

雜交譜系，例如巴西大西洋森林中的BdGPL×BdASIA-2/BdBRAZIL之間的譜系，可能比親本譜系更具毒性，根據(jù)混合活力理，Bd譜系的雜交在野外顯然很少見(jiàn)，但青蛙農(nóng)場(chǎng)可能會(huì)加劇新雜交種的風(fēng)險(xiǎn)。

由于Bd的生成時(shí)間短，預(yù)計(jì)牛蛙農(nóng)場(chǎng)的毒力會(huì)發(fā)生變化，主機(jī)容差高，宿主種群密度高，我們發(fā)現(xiàn)與野生青蛙相比，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)來(lái)自牛蛙農(nóng)場(chǎng)的分離株具有更高毒力的支持。

相反，當(dāng)Bd感染負(fù)荷超過(guò)100，000個(gè)游動(dòng)孢子時(shí)，B. ephippium的個(gè)體死亡，與分離株或來(lái)源無(wú)關(guān)。相比之下，10，000個(gè)游動(dòng)孢子的感染負(fù)荷閾值被認(rèn)為是水產(chǎn)繁殖物種的致命，表明這些閾值因生活史截然不同的物種而異。

我們?cè)谒拗鱾€(gè)體之間觀察到的Bd負(fù)荷的高度變化，可歸因于可以單獨(dú)或協(xié)同作用的多種因素，先天性和適應(yīng)性宿主免疫應(yīng)答的變化，基因表達(dá)，以前與病原體接觸過(guò)和主機(jī)壓力水平可能調(diào)節(jié)感染強(qiáng)度。除此之外，來(lái)自不同菌株的感染可能導(dǎo)致不同的Bd負(fù)荷。

我們的研究強(qiáng)調(diào)了牛蛙農(nóng)場(chǎng)在Bd傳播到本地宿主社區(qū)中可能發(fā)揮的突出作用。它表明，在牛蛙農(nóng)場(chǎng)進(jìn)化的Bd菌株，可能會(huì)通過(guò)將游動(dòng)孢子釋放到環(huán)境中來(lái)影響易感的本地物種。

結(jié)果表明，分布在世界各地的牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)為Bd，在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)外的生存、繁殖和傳播提供了潛在的環(huán)境，通過(guò)農(nóng)業(yè)減少壺菌傳播的一種可能方法是處理釋放到環(huán)境中的水。

牛蛙也應(yīng)使用先前報(bào)道的治療方法治療Bd感染，旨在治療和控制兩棲動(dòng)物養(yǎng)殖系統(tǒng)中，Bd的其他研究將有利于本地兩棲動(dòng)物保護(hù)工作。

實(shí)驗(yàn)室感染實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)接種，以測(cè)試不同Bd分離株對(duì)兩棲動(dòng)物宿主的影響。我們使用Brachycephalus ephippium作為實(shí)驗(yàn)宿主。短頭顱菌是巴西大西洋森林特有的直接發(fā)育物種，直接顯影劑在野外Bd患病率低，通常對(duì)壺菌病的抗性較低。

所以，它們是感染試驗(yàn)的理想模式生物。在巴西圣保羅州Mogi das Cruzes市收集了B. ephippium。我們單獨(dú)將每只野生捕獲的個(gè)體都裝在帶有落葉的塑料袋中，以避免青蛙在野外時(shí)潛在的交叉污染。

擦拭了所有個(gè)體青蛙，只使用那些在野外檢測(cè)出Bd陰性的青蛙。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們將每只青蛙，單獨(dú)安置在裝有高壓滅菌潮濕泥炭蘚的塑料盒中，每天監(jiān)測(cè)青蛙，并喂它們鈣強(qiáng)化針頭蟋蟀。在溫度受控的房間里進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，溫度設(shè)置為20°C，晝夜循環(huán)12小時(shí)。

我們將青蛙暴露于本研究農(nóng)場(chǎng)采樣的牛蛙中的三種Bd分離株，以及先前從本地兩棲動(dòng)物宿主分離和基因分型的三種Bd分離株，我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括七種處理，每次處理八只青蛙。

所有分離株都在BdGPL-2分支內(nèi)28，這是巴西大西洋森林的主要形式，我們將Bd分離物在培養(yǎng)皿中用胰蛋白胨瓊脂在17°C下培養(yǎng)五天。

然后，我們通過(guò)用蒸餾水淹沒(méi)培養(yǎng)皿，并等待大約一個(gè)小時(shí)，從游動(dòng)孢子囊中釋放出游動(dòng)孢子來(lái)收獲Bd游動(dòng)孢子，我們?cè)贜eubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中定量了游動(dòng)孢子，并標(biāo)準(zhǔn)化了接種物濃度中的分離株。

結(jié)論

使用具有二項(xiàng)分布的一般線性模型來(lái)測(cè)試宿主發(fā)育階段之間Bd患病率的差異;我們進(jìn)行了Tukey HSD后驗(yàn)測(cè)試以進(jìn)行多重比較，我們重復(fù)了這一分析，同時(shí)考慮到與目視檢查方法相關(guān)的假陰性和假陽(yáng)性的估計(jì)率。

運(yùn)行具有正態(tài)分布的GLM，以測(cè)試宿主發(fā)育階段之間Bd感染負(fù)荷的差異，我們對(duì)日志變換 感染負(fù)荷數(shù)據(jù)以獲得具有正態(tài)分布?xì)埐畹?GLM。

建立生存曲線來(lái)測(cè)試隔離源對(duì)個(gè)體宿主生存的影響。進(jìn)行類似的分析，以測(cè)試分離株對(duì)宿主存活的影響，我們使用廣義線性混合模型來(lái)測(cè)試暴露于，牛蛙Bd分離株的Bd感染負(fù)荷是否，高于暴露于本地青蛙分離株的Bd感染負(fù)荷。

包括作為隨機(jī)效應(yīng)的六種Bd分離株，對(duì)于這些分析，我們納入了實(shí)驗(yàn)中途（第16天）收集的樣本，并納入了在第16天之前死亡的個(gè)體的拭子，從該分析中排除了對(duì)照組。

我們還進(jìn)行了Tukey HSD后驗(yàn)檢驗(yàn)，用于均值之間的成對(duì)多重比較，使用簡(jiǎn)單的方差分析來(lái)測(cè)試暴露于不同分離株的個(gè)體在死亡點(diǎn)的平均感染負(fù)荷的差異。

(文：云杉奇談)

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