暴露于伊尼亞鏈球菌對遺傳改良養(yǎng)殖羅非魚microRNA表達的影響

基因改良的養(yǎng)殖羅非魚在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)時容易感染豬鏈球菌。GIFT是在中國南方廣泛養(yǎng)殖的具有重要商業(yè)價值的魚類。

實際上， GIFT 對獵鼻鏈球菌感染的調(diào)節(jié)反應(yīng)中的作用被低估了，頭腎在硬骨魚類中具有重要的免疫功能。主要目的是確定miRNA.在感染的 Gft 鏈球菌頭腎中的可能功能。

對從 GIFT 頭腎組織中提取的兩個文庫進行高通量深度測序，產(chǎn)生了 12，089，630和 12，624，975的干凈讀數(shù)。生物信息學(xué)分析分別在CO和IN文庫中鑒定了1736和1729個保守的miRNA以及164和165個新型miRNA。

發(fā)現(xiàn)三種miRNA上調(diào)，四種miRNA在感染鏈球菌感染的GIFT中下調(diào)。通過實時熒光定量PCR驗證了這些miRNA的表達。RNAhybrid和TargetScan用于識別互補的miRNA和mRNA靶位點，基因本體和京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫用于注釋和預(yù)測生物途徑的潛在下游調(diào)控。

豬非魚的爆發(fā)阻礙了中國羅非魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。了解感染的 Gift 鏈球菌感染 GIFT 的 miRNA 轉(zhuǎn)錄組對于探索 miRNA 調(diào)控的免疫應(yīng)答以及研究新型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以預(yù)防和治療未來豬鼻鏈球菌感染具有重要意義。

基因改良養(yǎng)殖羅非魚是中國南方具有重要商業(yè)價值的養(yǎng)殖魚類。糧食及農(nóng)業(yè)組織的數(shù)據(jù)顯示，約446個養(yǎng)殖國的羅非魚產(chǎn)量達到8萬噸。

由于其種內(nèi)交叉和相對快速的生長速度，在集約化培養(yǎng)系統(tǒng)中飼養(yǎng)時，GIFT極易感染由豬鏈球菌和無乳鏈球菌引發(fā)的細菌性疾病。更好地了解GIFT對感染的調(diào)節(jié)反應(yīng)將為免疫調(diào)節(jié)和GIFT育種提供關(guān)鍵信息。

魚類的非特異性免疫系統(tǒng)在感染的各個階段都起著重要作用。因此，了解免疫調(diào)節(jié)機制可能有助于更好地預(yù)防疾病。MicroRNA是小的非編碼單鏈RNA，存在于植物，動物和一些病毒中。

MiRNA通過與其靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)域結(jié)合，在RNA沉默和基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用。MiRNA介導(dǎo)的調(diào)控在先天免疫應(yīng)答、炎癥性疾病、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶向治療中;miRNA的功能主要在哺乳動物和植物中得到研究。

包含 645 個物種的 22335 個 miRNA，表達 8288 個成熟 miRNA。許多成熟的miRNA在脊椎動物分類群中高度保守，但它們在魚類宿主免疫反應(yīng)中的作用僅在少數(shù)物種中已知。

主要是斑馬魚，大型黃花魚和草魚，已經(jīng)鑒定并分類了幾種調(diào)節(jié)魚類先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的免疫特異性miRNA，包括miR-192，miR-194，miR-146a，miR-155a / b和miR-122。

哈維弧菌感染斑馬魚的miR-194和miR-146a顯著降低，脂多糖感染斑馬魚的miR-155a/b和miR-4下調(diào)Toll樣受體4和下游核因子kB活性。在接受聚核糖苷酸處理的感染大黃魚中檢測到miR-3-214p、miR-3-181p和miR-10c的上調(diào)表達。

let-118i和miR-4下調(diào)TLR3和核因子白細胞介素6-3，以應(yīng)對感染嗜水氣單胞菌的草魚的過度炎癥反應(yīng)。其中一些miRNA的異常調(diào)節(jié)會破壞細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)和炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致病理狀況。

近年來，使用各種分子生物學(xué)技術(shù)在羅非魚中檢測和鑒定了越來越多的免疫學(xué)相關(guān)基因。隨著尼羅羅河基因計劃的成功完成，miRNA介導(dǎo)的基因在免疫反應(yīng)中的表達和調(diào)控機制的研究將變得越來越重要。

尼羅魚miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)尚未報道，并且直到現(xiàn)在還沒有研究GIFT免疫應(yīng)答中miRNA表達譜的變化。目的是鑒定和分析參與GIFT對豬鼻鏈球菌感染免疫反應(yīng)的miRNA及其靶基因。

通過高通量測序?qū)碜愿腥?/span>豬鏈球菌的GIFT的兩個小RNA文庫和未感染的GIFT進行測序。鑒定了MiRNA，并使用RNA雜交和TargetScan預(yù)測miRNA靶基因，并使用基因本體和京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫探索下游靶基因的潛在生物加工。

鑒定了參與免疫應(yīng)答的miRNA及其靶基因，并通過定量實時PCR驗證了miRNA的表達譜。鑒定參與免疫調(diào)節(jié)的miRNA是更好地了解其在細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)和炎癥反應(yīng)中的功能的必要先決條件。

由豬鏈球菌引起的鏈球菌病無疑是羅非魚的主要細菌性疾病之一。據(jù)報道，它在中國四個以上省份的羅非魚養(yǎng)殖區(qū)造成巨大死亡和經(jīng)濟損失。很少有研究描述羅非魚中miRNA介導(dǎo)的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的分子機制。

實驗前確定96小時半致死性豬鏈球菌劑量在禮物是 107氟氯化鉀-1。GIFT感染濃度為107氟氯化鉀-1可刺激自身免疫系統(tǒng)應(yīng)對細菌入侵后24小時感染伊尼奧鏈球菌，存活率為90%。

在之前的一項研究中，發(fā)現(xiàn)感染鏈球菌感染的GIFT頭部腎組織中C型溶菌酶、熱休克蛋白70、白細胞介素-1β、干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α在感染后96 h達到峰值。

延長感染時間削弱了魚自身的免疫反應(yīng)，在感染后2 h和36 h注射487氟氯化鉀-1.在GIFT感染24小時LD96小時后出現(xiàn)以下癥狀50、病魚開始在水中間歇性旋轉(zhuǎn)，游泳動作不平衡，眼白角膜混濁，脾臟腫大發(fā)紅，肝充血，腎臟出血，膽囊腫大，膽汁呈深綠色。

腎臟出血可能是由于淋巴細胞減少和大量紅細胞替代，以及巨噬細胞浸潤率高。巨噬細胞可以通過吞噬作用減少細菌入侵。在細菌感染的早期階段，頭腎被發(fā)現(xiàn)是成年魚中重要的免疫調(diào)節(jié)組織，并且被認為在哺乳動物中起著與骨髓相似的作用。

頭腎主要由粒細胞、巨噬細胞以及存在任何獲得性特異性或非特異性免疫調(diào)節(jié)的T和B淋巴細胞組成。在這項研究中，鑒定參與抗病原體感染和miRNA介導(dǎo)的調(diào)控途徑的miRNA，以更好地了解由豬粒鏈球菌挑戰(zhàn)引發(fā)的羅非魚頭腎的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。

建立來自感染豬鼻鏈球菌的GIFT頭腎和未感染的GIFT的兩個小RNA文庫并對其進行測序。分別從 CO 和 IN 庫共獲得了 2412423和 33812845 個原始讀取。

刪除包含適配器序列和低質(zhì)量讀取的讀取后，CO 和 IN 庫中分別保留了 112089 和 63012624個干凈讀取。發(fā)現(xiàn)975.38%和63.39%的讀數(shù)在檢索數(shù)據(jù)庫中沒有匹配，這些未注釋的序列被認為是唯一的讀取。

總清潔讀數(shù)包含16.72%和08.64%的保守miRNA，唯一讀數(shù)包含36.13%和94.11%的保守miRNA。

發(fā)現(xiàn)264661和312600的獨特讀段以及164和165個候選新型miRNA可以映射到尼羅羅非魚基因組序列。兩個庫中讀取序列的長度范圍從10 nt到44 nt，其中22 nt，21 nt和23 nt長讀取最豐富。

已使用庫中的讀段數(shù)來估計測序樣本中讀段的豐度。CO文庫中豐度最高的十種miRNA是miR-6585-5p，miR-181a，miR-181a-5p，miR-462，miR-92a-3p，miR-26-5p，miR-26a-5p，miR-10b-5p，miR-10b和miR-26a，它們占映射到miRBase序列的讀段的35.4%。

這些miRNA中有6585個是IN文庫中十個最豐富的miRNA，占映射到miRBase序列的讀段的2.181%。在這些miRNA中，miR-92a、miR-3a-26p、miR-5a-10p、miR-26b和miR-20a在人類免疫調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)中起重要作用。

選擇并分析了19個差異表達的miRNA，在CO和IN文庫之間有超過10個讀數(shù)。在19個miRNA中，92個顯著上調(diào)，92個與CO文庫相比顯著下調(diào).，使用RNA雜交和TargetScan與尼羅羅羅魚基因組序列篩選假定的miRNA靶基因。

用GO項注釋候選靶基因，并將4個生物過程分配給預(yù)測靶標熱圖表明，這些差異表達的miRNA可能在免疫調(diào)節(jié)、信號傳遞和細胞過程中發(fā)揮重要作用。

為了驗證從轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)估計的表達水平，通過qRT-PCR測量了八種miRNA的表達水平。選擇八種miRNA是因為它們在感染后具有相對較高的倍數(shù)變化。

PCR結(jié)果顯示，與CO組相比，IN組的miR-310-3p、miR-92和miR-127顯著上調(diào)，miR-92d-3p、miR-375-5p、miR-146-3p和miR-694顯著下調(diào)，與從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的結(jié)果一致。這與從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的結(jié)果相矛盾。

先前的觀察表明，miR-146，miR-127，miR-92a，miR-310，miR-375和miR-694在魚類和哺乳動物中起著重要的免疫調(diào)節(jié)功能。Zhang等人最近的一項研究發(fā)現(xiàn)。

miR-26a在暴露于脾弧菌和脂多糖的海參中上調(diào)，其靶基因被預(yù)測為E92泛素蛋白連接酶，可能通過調(diào)節(jié)參與轉(zhuǎn)化生長因子-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白的信號通路來充當腫瘤抑制因子，在乳腺癌患者中，腫瘤組織和血清中發(fā)現(xiàn)miR-27a水平下調(diào)。

轉(zhuǎn)基因克隆羊中miR-28失調(diào)介導(dǎo)了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子樣基因127的表達，Rtl1是可能導(dǎo)致發(fā)育遲緩的關(guān)鍵胎盤發(fā)育基因。MiR-694在Lass II基因敲除小鼠的肝臟中被下調(diào)，可能與肝臟失調(diào)與代謝功能障礙之間的關(guān)聯(lián)有關(guān)。

發(fā)現(xiàn)MiR-375過表達可抑制肺表面活性物質(zhì)的分泌，可能通過影響患者的肌動蛋白動力學(xué)和損傷胰腺。作為腫瘤抑制因子或癌基因，miR-310/13簇可能調(diào)節(jié)癌癥中進化保守的免疫信號網(wǎng)絡(luò)。

參與免疫相關(guān)反應(yīng)的七個基因被預(yù)測為七個miRNA的靶標。補體C3和胞苷脫氨酶分別被預(yù)測為miR-92d-3p和miR-127的潛在靶標。據(jù)報道，補體C3 mRNA水平在實驗性感染引發(fā)的大型黃花魚和Miiuy黃花魚。

補體C3的上調(diào)與先天免疫有關(guān)，先天免疫在應(yīng)激后介導(dǎo)組織損傷中起重要作用。發(fā)現(xiàn)IN庫中補體C3的水平明顯上調(diào)，表明其作為抗炎反應(yīng)防御入侵病原體的潛在調(diào)節(jié)劑的作用。

胞苷脫氨酶是一種誘變激活誘導(dǎo)的DNA/RNA編輯酶，與人類腫瘤發(fā)生有關(guān)。在幽門螺桿菌感染的胃上皮細胞中發(fā)現(xiàn)胞苷脫氨酶水平異常，有人認為這可能是亞顯微鏡缺失和體細胞突變積累的機制。

水生動物中的胞苷脫氨酶水平研究很少。結(jié)果表明，胞苷脫氨酶mRNA在感染24 h后下調(diào)表達可能與傳染病和免疫介導(dǎo)的疾病有關(guān)。

Mapk信號通路的調(diào)節(jié)可能調(diào)節(jié)細胞周期基因的轉(zhuǎn)錄，這已被證明對于介導(dǎo)許多細胞過程至關(guān)重要，包括炎癥反應(yīng)、細胞應(yīng)激、細胞分化和細胞增殖。TNF-α是癌細胞中主要的促炎細胞因子。

代謝性谷氨酸受體因其在突觸信號傳導(dǎo)中的作用而廣為人知。異常谷氨酸信號傳導(dǎo)已被證明參與人類癌癥的轉(zhuǎn)化和維持，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤皮膚癌、乳腺癌和前列腺癌。

結(jié)論

健康成年雄性GIFT取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興羅非魚養(yǎng)殖場。魚的平均重量為350±19克。在室內(nèi)混凝土水箱中養(yǎng)殖魚，并在處理前適應(yīng)2周。在馴化過程中，水溫保持在28±0.3°C，魚保持在自然光周期和連續(xù)通氣下。

并使用相對定量管理器軟件進行比較。使用未配對的學(xué)生T檢驗來分析qRT-PCR表達結(jié)果。

(文|小虎史談)

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