論文：鯽鰓出血病2種病原菌的分離及鑒定

鯽鰓出血病2種病原菌的分離及鑒定

朱 潛，姚雪梅，沈 鋒，張世馳，于 娜，高茂林

(海南大學(xué)海洋學(xué)院，海口 570228)

鯽(Carassiusauratus)屬鯉形目鯉科，肉質(zhì)細(xì)嫩營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，是我國(guó)重要食用魚類之一。鰓出血病是淡水魚較嚴(yán)重的一種惡性傳染病，主要特征為鰓部腫脹、出血，嚴(yán)重者體表點(diǎn)狀充血、鰭基部發(fā)紅、腸道有炎癥、腹腔積水、肝臟發(fā)白。該病最初在2009-2010年零星發(fā)生于江蘇省蘇北射陽(yáng)縣鯽養(yǎng)殖池塘；次年夏末在鹽城地區(qū)出現(xiàn)較大面積的暴發(fā)，引起大量死亡，甚至蔓延至江蘇各省，對(duì)江蘇地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年，該病不僅流行于整個(gè)蘇北地區(qū)，同時(shí)在東北地區(qū)、華中地區(qū)也零星發(fā)生[1-2]。為避免造成更大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)影響，應(yīng)查明鰓出血病的起因，從而有效地預(yù)防和防治這種疾病。孟思好等[3]2011年8-11月和2012年4-10月，從蘇北地區(qū)部分水產(chǎn)養(yǎng)殖基地患“鰓出血病”銀鯽體內(nèi)分離出5個(gè)菌株，但人工感染致病菌的試驗(yàn)魚卻并未出現(xiàn)與自然條件下 “鰓出血病”相同癥狀，因此提出鰓出血病可能由病毒與細(xì)菌混合感染引起。王會(huì)聰?shù)萚4]調(diào)查江蘇省射陽(yáng)縣鹽場(chǎng)區(qū)域的100個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，發(fā)現(xiàn)鯽鰓出血病與溫度密切相關(guān)。吳霆等[5]通過組織病理學(xué)、回歸感染試驗(yàn)、分子生物學(xué)診斷等研究方法，證實(shí)異育銀鯽鰓出血病病原為鯉科皰疹病毒-Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)。

2013年6月，黑龍江省哈爾濱市某鯽養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)嚴(yán)重的鰓出血癥。從典型病癥魚體的鰓部中分離到2種致病細(xì)菌(Q-120和B-15)，對(duì)健康鯽進(jìn)行人工腹腔注射感染和體外溶血試驗(yàn)，確定其具有致病性。結(jié)合16S rRNA 基因序列比對(duì)及進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)分析，確定了該致病菌的種類和分類地位，旨在為鯽鰓出血病的發(fā)病機(jī)理、流行規(guī)律、藥物與免疫預(yù)防技術(shù)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

病鯽：取自哈爾濱某養(yǎng)殖場(chǎng)。經(jīng)解剖觀察，發(fā)現(xiàn)病魚皮膚潰爛有白點(diǎn)，體表、各鰭基部、眼眶等處出血，肛門紅腫；其鰓絲整齊并附有粘液，掀開鰓蓋后發(fā)現(xiàn)有特別明顯的凝血現(xiàn)象。鏡檢發(fā)現(xiàn)鰓絲充血腫脹嚴(yán)重或伴有爛鰓，未見寄生蟲的存在(圖1)。

回歸感染試驗(yàn)魚：健康鯽體重100 g左右，購(gòu)于哈爾濱某養(yǎng)殖場(chǎng)。

分離與檢測(cè)用噬纖維菌培養(yǎng)基、PCR所用引物及試劑、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均由上海生工生物工程有限公司提供。藥敏紙片購(gòu)自北京天壇中國(guó)藥品生物制品檢定所。

圖1 病魚主要特征Fig.1 The major characteristics of diseased fish (A 鰓部具有明顯的凝血現(xiàn)象，B 體表、 各鰭基部等處出血且肛門紅腫，C 鏡檢鰓絲充 血腫脹嚴(yán)重并伴有爛鰓(10×))

1.2 致病菌的分離和培養(yǎng)

用75%酒精對(duì)具有明顯癥狀病魚表面進(jìn)行消毒處理，從鰓部取少量組織研磨成糊，加入10 mL 0.5%的無(wú)菌生理鹽水混勻，取菌液1 mL，依次制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等稀釋度備用。取100 μL上述每個(gè)稀釋度(每個(gè)稀釋度取3個(gè)平行)接種于噬纖維菌培養(yǎng)基(蛋白胨0.18%，酵母膏0.09%，牛肉膏0.09%，葡萄糖0.09%，碳酸氫鈉0.18%，氯化鈉0.3%，瓊脂2.0%，pH7.0～7.4)平板上，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。對(duì)初篩的各個(gè)單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并記錄單菌落的形態(tài)特征。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定

將平板上兩種優(yōu)勢(shì)的典型菌落，分別命名Q-120和B-15菌落。將兩種菌落的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，在光鏡下檢查細(xì)菌的形態(tài)特征和染色結(jié)果。另取病魚鰓絲壓片觀察鰓絲粘液中致病細(xì)菌的形態(tài)特征，并與從菌落中挑取細(xì)菌的形態(tài)特征進(jìn)行比對(duì)。

1.3.2 16S rRNA序列測(cè)定和進(jìn)化樹構(gòu)建

將2種細(xì)菌接種于噬纖維菌培養(yǎng)基中，28 ℃震搖 24 h后離心收集菌體，按照細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總 DNA，作為 PCR 模板。利用特異性引物Bac-F2：5 aga gtt tga tca tgg ctc ag 3和Bac-R2：5 acg gct acc ttg tta cga ctt 3進(jìn)行16S rRNA 基因片段擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件均為：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 20 s，共34個(gè)循環(huán)； 最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行序列測(cè)定。將所測(cè)序列與GenBank中的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，然后從匹配度高的序列中選取部分相關(guān)的16S rRNA序列，用Mega 5.0軟件采用最大似然法(ML法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 回歸感染試驗(yàn)

將分離出的兩株優(yōu)勢(shì)菌Q-120和B-15，純培養(yǎng)于噬纖維菌培養(yǎng)基斜面上，24 h后用無(wú)菌生理鹽水制成濃度2.0×108個(gè)/mL 的菌懸液進(jìn)行腹腔注射。取體重100 g左右的健康魚40尾，分成4組進(jìn)行感染試驗(yàn)。感染組為3組，分別為Q-120、B-15與兩種菌的混和感染組，注射量為菌懸液0.2 mL/尾；對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水0.2 mL/尾。試驗(yàn)魚飼養(yǎng)在25 ℃的充氣水族箱中，觀察魚的生活及發(fā)病情況。致病后對(duì)出現(xiàn)典型病魚的鰓部再進(jìn)行細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)，與養(yǎng)殖場(chǎng)的病魚分離菌進(jìn)行對(duì)照。

1.5 致病菌的體外溶血試驗(yàn)

2%紅細(xì)胞懸液的制備：健康魚心臟采血5 mL，置放在有玻璃珠的小試管中，輕微攪拌去除纖維蛋白。將血移入裝有10 mL生理鹽水的離心管中，混勻后2 500 r/min離心5 min，棄去上清液，重復(fù)3～4次至上清液呈無(wú)色透明為止。將洗滌好的紅細(xì)胞用生理鹽水配制成2%的細(xì)胞懸液，備用。

體外溶血測(cè)定：取9支10 mL的試管編號(hào)分成9組,其中第1～8組為實(shí)驗(yàn)組，第9組為對(duì)照組。每組首先各加入2%紅細(xì)胞懸液2.5 mL。第1～4組再依次加入2.5、1、0.5、0.1 mL的Q-120菌懸液(濃度為2.0×108CFU/mL )；第5～8組再按上述濃度梯度依次加入B-15菌懸液(濃度為2.0×108CFU/mL )，最后用無(wú)菌生理鹽水將9支試管定容至5 mL，室溫下靜置30 min后，觀察并記錄各組的溶血情況。

1.6 藥物敏感實(shí)驗(yàn)

28 ℃培養(yǎng)過夜的Q-120和B-15液體培養(yǎng)物涂布于噬纖維菌平板，適當(dāng)干燥后貼藥敏紙片,每皿6片，每種藥物2片平行，28 ℃培養(yǎng)24 h 后測(cè)定抑菌圈直徑，按產(chǎn)品說明書判定對(duì)藥物的敏感度。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的鑒定

2.1.1 病原菌的分離和形態(tài)觀察

將2種優(yōu)勢(shì)菌Q-120、B-15在噬纖維菌培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察發(fā)現(xiàn)Q-120菌落顏色與培養(yǎng)基的顏色接近呈微黃色，菌落直徑約2 mm，培養(yǎng)48 h后菌落顏色加深為淺黃色，菌層增厚似水滴狀，中間厚，邊緣向四周微擴(kuò)散，菌落直徑可持續(xù)增大至4 mm左右；菌株B-15菌落顏色為白色，菌落直徑較小約1～2 mm，48 h后菌落顏色為白色，表面光滑，菌落也似水滴狀，菌落直徑可增大至3 mm左右。

試驗(yàn)分離的2種優(yōu)勢(shì)菌Q-120、B-15均為革蘭氏陰性桿菌，菌體兩端鈍圓，稍彎，多數(shù)單個(gè)排列，無(wú)芽孢，有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。在顯微鏡下觀察菌株Q-120長(zhǎng)約0.5～2.0 μm，菌株B-15長(zhǎng)約0.6～2.5 μm。這與活體鰓絲壓片觀察結(jié)果基本一致。

2.1.2 兩種病原菌16S rRNA基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

以菌株Q-120的基因組為模板，擴(kuò)增獲得16S rRNA部分序列，長(zhǎng)度為1 451 bp(不計(jì)引物長(zhǎng)度)，并在Genbank上注冊(cè)(登錄號(hào)KP313244)。Blast比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)該序列與維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)16S rRNA同源性在99%以上，且與登錄號(hào)KJ704986.1的維氏氣單胞菌序列同源性達(dá)到100%。采用ML法所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Q-120菌株與維氏氣單胞菌、維氏溫和氣單胞菌生物變種(A.sobria)聚類處于同一進(jìn)化分支,可確定該分離菌為維氏氣單胞菌(圖2)。

以B-15的兩個(gè)菌株(B-15-1和B-15-2)基因組為模板，擴(kuò)增獲得16S rRNA部分序列，長(zhǎng)度為1 462 bp(不計(jì)引物長(zhǎng)度)，分別在Genbank上注冊(cè)(登錄號(hào)：KU949379和KU949380)。Blast比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)該序列與GenBank上登錄號(hào)為JN644526.1、KC660137.1和KC990811.1的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)16S rRNA同源性高達(dá)99%以上，且位于進(jìn)化樹同一分支，可確定該分離菌為陰溝腸桿菌(圖3)。

圖2 基于16S rRNA 序列構(gòu)建的氣單胞菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Aeromonas based on 16S rRNA (★為本研究的維氏氣單胞菌，刻度尺上的數(shù)字為遺傳距離)

圖3 基于16S rRNA 序列構(gòu)建的陰溝腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Enterobacter cloaca based on 16S rRNA (★為本研究的陰溝腸桿菌，刻度尺上的數(shù)字為遺傳距離)

2.2 回歸感染試驗(yàn)

腹腔注射致病菌的健康魚均出現(xiàn)典型的自然發(fā)病癥狀。感染維氏氣單胞菌(Q-120)病魚起初體表大量潰爛，攝食下降，游動(dòng)緩慢，尾部明顯短?。? d后魚開始死亡，解剖發(fā)現(xiàn)腎臟呈褐色，膽囊腫大，魚鰓腫脹或鰓邊緣潰爛，少數(shù)病魚伴有鰓出血現(xiàn)象，死亡率為90%。感染陰溝腸桿菌(B-15)的病魚起初攝食下降，游動(dòng)緩慢，頭部、軀干部、尾部等多處潰爛，鰭、鰓部出血；3 d后魚開始死亡，解剖發(fā)現(xiàn)鰓顏色發(fā)紅并伴有明顯凝血現(xiàn)象，腸道萎縮，腹部滲出大量黃色液體，死亡率也為90%，其引起的鰓出血現(xiàn)象較維氏氣單胞菌更為明顯。維氏氣單胞菌與陰溝腸桿菌混合感染的病魚出現(xiàn)了兩種菌感染的所有癥狀，死亡率高達(dá)100%。因此可確認(rèn)維氏氣單胞菌、陰溝腸桿菌兩菌株均為致病菌，而陰溝腸桿菌引起的鰓出血和凝血癥狀更明顯，且兩菌株有協(xié)同作用，即二者混合感染時(shí)致病率及死亡率增高。

2.3 致病菌的體外溶血試驗(yàn)

本試驗(yàn)考驗(yàn)不同濃度的維氏氣單胞菌(Q-120)、陰溝腸桿菌(B-15)對(duì)健康魚紅細(xì)胞的影響。溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1：注射Q-120組0.5 h后就開始溶血，菌濃度越高，溶血程度越高，其1號(hào)組出現(xiàn)全溶。與維氏氣單胞菌組相比，陰溝腸桿菌組溶血速率明顯慢很多，12 h后才開始溶血，其溶血程度也是隨菌體濃度增高而加快。對(duì)照組未出現(xiàn)溶血。

表1 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The result of hemolysis test

注：R-溶血，N-表示不溶

2.4 藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從5種藥物的敏感實(shí)驗(yàn)得出，Q-120(維氏氣單胞菌)對(duì)氟苯尼考與諾氟沙星敏感，而對(duì)其他3種藥都具有耐藥性。Q-120較B-15(陰溝腸桿菌)出現(xiàn)了更強(qiáng)的耐藥性(表2)。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The sensitivity of the isolated strains to test chemotherapentants

注:-為耐藥;+-：弱敏感；+為中度敏感；++為強(qiáng)敏感

3 討論

鯽鰓出血病是近年來新出現(xiàn)的流行范圍廣、死亡率高、危害和損失大的急性病。本研究表明，分離的Q-120、B-15菌株在人工感染試驗(yàn)中具有較強(qiáng)的致病力，感染的病魚出現(xiàn)與自然患病魚相似的鰓出血等癥狀，本實(shí)驗(yàn)鑒定Q-120為維氏氣單胞菌(A.veronii)、B-15為陰溝腸桿菌(E.cloacae)，兩者均為鯽鰓出血病的致病菌。

維氏氣單胞菌(A.veronii)，隸屬于弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，是一類革蘭氏陰性桿菌。該菌普遍存在于淡水、污水、淤泥及土壤中，其主要致病因子為氣溶素(aerolysin)、腸毒素(enterotoxin)等，致病范圍極其廣泛，可引起中華絨鰲蟹、錦鯉、斑點(diǎn)叉尾鮰及包括人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物感染病癥，已逐漸對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[6-8]。本研究通過人工感染和體外溶血實(shí)驗(yàn)也證明維氏氣單胞菌對(duì)鯽具有很強(qiáng)的致病性。從藥敏試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌比陰溝腸桿菌具有更強(qiáng)的耐藥性。這說明鯽的大量快速死亡可能更多是因?yàn)榫S氏氣單胞菌的溶血作用。

陰溝腸桿菌(E.cloacae)，屬腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)腸桿菌屬(Enterobacter)，廣泛存在于自然界中，在人和動(dòng)物的糞便、水、泥土、植物中均可檢出陰溝腸桿菌，屬人類腸道正常菌種之一，但該種菌也是一種條件致病菌，產(chǎn)毒素，可引起敗血癥等[9]。該種菌容易出現(xiàn)較強(qiáng)的耐藥性，而且可能又是由六個(gè)菌群復(fù)合組成[10]。目前國(guó)內(nèi)外未見陰溝腸桿菌在魚類上感染致病的報(bào)道，本研究首次發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌可寄生于鯽，并能引起出血及腹腔腹水等癥狀。我們的藥敏試驗(yàn)表明該菌對(duì)目前的5種常用藥，1種出現(xiàn)耐藥性，2種是弱敏感。因只是檢測(cè)了5種藥敏試紙，所以還需要更大量的藥敏實(shí)驗(yàn)來說明其是否具有多重耐藥性。另外最新的研究顯示這種菌在人類腸道的大量出現(xiàn)可引起非酒精性脂肪肝及肥胖[11]，該研究提示可能這種菌的出現(xiàn)與魚體內(nèi)脂肪的代謝失調(diào)有一定的關(guān)系。

此外體外溶血實(shí)驗(yàn)表明，兩種菌均對(duì)魚的紅細(xì)胞有較強(qiáng)的溶血作用。人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種病菌均能引起健康魚體表大量潰爛、鰓部凝血、腸道炎癥、腹腔積水等，但陰溝腸桿菌引起的鰓出血癥狀(尤其出現(xiàn)鰓部出血、凝血現(xiàn)象)要比維氏氣單胞菌要明顯很多?；旌细腥緯r(shí)，出現(xiàn)典型的鯽鰓出血病的癥狀(鰓部腫脹、出血、凝血，鰭基部發(fā)紅、腸道有炎癥、腹腔積水)，與養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)采集病魚的癥狀吻合，這表明陰溝腸桿菌很可能是一種潛在的機(jī)會(huì)型致病菌，可協(xié)同其它致病性細(xì)菌引起“鰓出血病”綜合征。這一結(jié)果為魚類出血病的有效防治提供了重要的依據(jù)。