論文：魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病的研究進(jìn)展

魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病的研究進(jìn)展

朱志東 ，呂莉 ，鄧劍壕 ，馮豆 ，許佳楠 ，蔡延渠 ，辛年香 ，朱盛山

（1.廣東藥科大學(xué)中藥開(kāi)發(fā)研究所，廣東 廣州 510006；2.廣州普精生物科技有限公司，廣東 廣州 510006）

諾卡氏菌病（Nocardiosis）是由諾卡氏菌引起的一種人獸共患的慢性傳染病。我國(guó)1980年首次報(bào)道了諾卡菌病例，截至目前已報(bào)道至少有13個(gè)?。ㄖ陛犑?、自治區(qū)）的人群中存在諾卡氏菌的感染[1]。諾卡氏菌病在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面危害極大[2－3]，在亞洲地區(qū)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)中諾卡氏菌病頻發(fā)，發(fā)病魚(yú)種包括鰤[4－5]、鯧[6－8]、大黃魚(yú)[9]、招財(cái)魚(yú)[10]、羅非魚(yú)[7]、烏鱧[11]、大口黑鱸[11]、石斑魚(yú)[7]、四指馬鲅[7]、紫紅笛鯛[7]、紅笛鯛[7]、六帶鲹[7]等。隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的提高，養(yǎng)殖過(guò)程中的疾病也日趨嚴(yán)重，魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病自然發(fā)病率可達(dá)到15%～30%，嚴(yán)重的達(dá)到60%，人工感染的病死率可高達(dá)90%～100%[12]。近年來(lái)魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病引起越來(lái)越多學(xué)者的廣泛關(guān)注，抗生素治療細(xì)菌感染性疾病難以根治，由于用藥療程長(zhǎng)，長(zhǎng)期使用抗生素容易產(chǎn)生耐藥性，抗生素殘留也會(huì)導(dǎo)致人體蓄積性中毒，而中藥對(duì)人毒性低，不易引起細(xì)菌耐藥性[13]，在治療魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病具有很大優(yōu)勢(shì)，如本課題組蔡延渠[18－19]論述用中草藥抗胃腸道細(xì)菌感染和呼吸道細(xì)菌感染的療效，發(fā)現(xiàn)中草藥是臨床治療胃腸道細(xì)菌和呼吸道細(xì)菌感染的另一良好“替代抗生素”；如本課題組周澤琴[2]研究的中藥復(fù)方NZ方抑菌性顯著，對(duì)副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌的最低抑菌濃度僅為0.313 mg/mL，如何有效防治諾卡氏菌病對(duì)魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的侵襲也備受水產(chǎn)業(yè)界人士關(guān)注和重視。

魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病的致病菌主要是鰤?mèng)~諾卡氏菌（N.seriolae）[14－17]、星狀諾卡氏菌（N.Asteroides）[10]，本文就魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病的流行環(huán)境、診斷方法以及防治手段等方面進(jìn)行綜述，希望為魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病的防治提供參考。

1 流行環(huán)境

魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病以水溫在25～28℃時(shí)發(fā)病最為嚴(yán)重。該病流行季節(jié)較長(zhǎng)，發(fā)病魚(yú)常為1齡或2齡魚(yú)，發(fā)病高峰主要集中在6—9月份。發(fā)病時(shí)魚(yú)一般不吃食，環(huán)境變化后，尤其在雨后，發(fā)生死亡現(xiàn)象更加嚴(yán)重[12、23]。

2 診斷方法

2.1 主要癥狀

患病初期，反應(yīng)遲鈍，食欲下降，有時(shí)肛門(mén)紅腫，體表無(wú)明顯癥狀；患病中期，體表有損傷、潰爛，腹部膨脹等現(xiàn)象；患病晚期，背部、腹部和尾部體表?yè)p傷并潰爛出血，更有甚者體表形成膿腫或瘺管，隨后逐漸死亡[20－22]。

2.2 解剖

王國(guó)良等[11]取浙江蕭山患鰤?mèng)~諾卡氏菌病的烏鱧解剖，膨大的腹腔內(nèi)有少量透明或淡黃色液體，在肝、脾、腎等內(nèi)臟組織中出現(xiàn)乳白色或淡黃色結(jié)節(jié)，直徑0.1～0.5 cm。黃郁蔥等[22]從湛江港、陽(yáng)江閘坡取海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的患鰤?mèng)~諾卡氏菌病的卵形鯧鲹進(jìn)行解剖，肝、腎臟、脾臟充血并腫大，鰓、肝、腎臟、脾臟、鰾、腸系膜等有大量直徑0.1～0.3 cm的白色結(jié)節(jié)。林偉等[10]取信陽(yáng)市患星狀諾卡氏菌病的招財(cái)魚(yú)，解剖觀察，有黃色腹水，肝、脾、腎明顯腫大并有直徑0.1～0.5 cm的白色結(jié)節(jié)。

魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病又稱結(jié)節(jié)病，可在內(nèi)臟各器官形成肉眼可見(jiàn)直徑0.1～0.5 cm的大量白色結(jié)節(jié)，以脾臟和腎臟最為顯著[24]。但除諾卡氏菌感染會(huì)引起魚(yú)內(nèi)臟器官出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)外，殺魚(yú)巴斯德氏菌、嗜水氣單胞菌、哈維氏弧菌、惡臭假單胞菌、維羅納氣單胞菌等致病菌亦會(huì)導(dǎo)致魚(yú)腹腔或內(nèi)臟器官出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)的癥狀，所以，發(fā)現(xiàn)患病魚(yú)內(nèi)臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)癥狀，也不能就絕對(duì)的認(rèn)為這是魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病[25－26]。

2.3 生物技術(shù)

王國(guó)良等[27]針對(duì)鰤?mèng)~諾卡氏菌16S—23S rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列，設(shè)計(jì)了四條LAMP引物，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)電泳后呈現(xiàn)特異性的LAMP梯形條帶，建立LAMP法，對(duì)患病烏鱧、大黃魚(yú)、黃姑魚(yú)組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鰤?mèng)~諾卡氏菌DNA的LAMP擴(kuò)增為陽(yáng)性。蔣依依等[28]根據(jù)鰤?mèng)~諾卡菌16S—23S轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了鰤?mèng)~諾卡氏菌特異性PCR快速檢測(cè)方法，并對(duì)鰤?mèng)~諾卡氏菌人工感染的大口黑鱸組織進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果從大口黑鱸組織中檢出陽(yáng)性鰤?mèng)~諾卡菌ITS序列擴(kuò)增片段、陽(yáng)性率100%，比傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定方法更加靈敏、快速且高效。王國(guó)良等[29]根據(jù)GenBank中鰤?mèng)~諾卡氏菌16S—23S rRNA基因序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，經(jīng)反應(yīng)體系優(yōu)化后建立了檢測(cè)魚(yú)諾卡氏菌的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，后提取患病大黃魚(yú)DNA作SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，鰤?mèng)~諾卡氏菌DNA擴(kuò)增為陽(yáng)性，進(jìn)而檢測(cè)出大黃魚(yú)鰤?mèng)~諾卡氏菌病，為魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病的早期快速檢測(cè)與防控提供有效的技術(shù)支持[31]。

3 防治

3.1 化學(xué)藥

蔣依依等[30]取患病加州鱸體內(nèi)分離鰤?mèng)~諾卡氏菌，采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定其對(duì)10種抗生素的敏感性，該菌株對(duì)四環(huán)素和氯霉素高度敏感，抑菌圈直徑為57 mm、48 mm；對(duì)磺胺類(lèi)和氨芐青霉素最不敏感，抑菌圈直徑都為0 mm。曹錚等[31]從患病烏鱧體內(nèi)分離的鰤?mèng)~諾卡氏菌，通過(guò)紙片擴(kuò)散法研究其對(duì)14種常用抗生素的敏感性，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)紅霉素最敏感，抑菌圈直徑分別為46 mm；對(duì)阿米卡星、新霉素、青霉素G、先鋒V等耐藥，抑菌圈直徑分別為 14 mm、12 mm、0 mm、0 mm。林偉等[32]對(duì)發(fā)病招財(cái)魚(yú)體內(nèi)分離得到的星狀諾卡氏菌，用紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)其對(duì)14種抗生素的藥敏性，紅霉素最敏感，抑菌圈直徑達(dá)45 mm，其次為環(huán)丙沙星，抑菌圈直徑為32 mm；對(duì)阿米卡星、新霉素、青霉素G、先鋒V等耐藥抑菌圈直徑分別為13 mm、16 mm、0 mm、0 mm。

滿其蒙等[33]研究用紅霉素、恩諾沙星、氟苯尼考治療卵形鯧鲹鰤?mèng)~諾卡氏菌病的效果，人工腹腔注射感染后，對(duì)第1天投藥和第4天投藥的治療情況進(jìn)行比較，給藥劑量20 mg/（kg·d），拌料投喂，連續(xù)投喂10天。結(jié)果顯示，攻毒后第一天投藥、攻毒后第4天投藥及預(yù)防組治療效果較好的分別是恩諾沙星、紅霉素及氟苯尼考，其對(duì)卵形鯧鲹、鰤?mèng)~諾卡氏菌感染的保護(hù)率分別為53.4%、30%及26.7%。孟思妤[34]用22.0 mg/kg魚(yú)體質(zhì)量的氨芐青霉素治療，拌料后陰干投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂6 d，發(fā)現(xiàn)烏鱧的死亡數(shù)量只有十幾條；用20.0 mg/kg魚(yú)體質(zhì)量的交沙霉素治療，拌料后陰干投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂5 d后烏鱧死亡數(shù)量明顯下降，但是，用藥后第9天每天烏鱧死亡數(shù)量還有300尾以上。

3.2 生物藥

解俊等[35]應(yīng)用濃度為108CFU/mL的0.4%甲醛滅活鰤?mèng)~諾卡氏菌對(duì)烏鱧進(jìn)行腹腔注射，劑量為0.5 mL/尾，對(duì)照組同法等量注射滅菌生理鹽水。分別在實(shí)驗(yàn)第 0、3、6、9、12、15、18、21 d 抽取烏鱧血液，測(cè)定其血細(xì)胞數(shù)、血清總蛋白含量及血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶活性。與對(duì)照組相比，注射滅活鰤?mèng)~諾卡氏菌后，烏鱧血細(xì)胞數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)第12天時(shí)注射組血細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組90.33×1010cell/L；血清總蛋白含量在實(shí)驗(yàn)第9天后均高于對(duì)照組且第9天的峰值比第21天大0.96金氏單位/100 mL；血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶等活性在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)均有所增強(qiáng)。研究表明，滅活菌苗的刺激能引起烏醴血細(xì)胞的增殖以及血清中各非特異性免疫指標(biāo)的變化，從而提高機(jī)體自身的免疫保護(hù)力。

3.3 中草藥

目前，研究中藥治療諾卡氏菌病的較少。舒孝順等[36]使用K－B紙片法測(cè)定菝葜水提物對(duì)諾卡氏菌等細(xì)菌的敏感性，發(fā)現(xiàn)菝葜水提物2 mg/片對(duì)諾卡氏菌敏感，抑菌圈直徑為10.3 mm；進(jìn)一步使用二倍稀釋平皿法測(cè)定其對(duì)諾卡氏菌的MIC值，結(jié)果為2.08 g/mL。

4 討論與總結(jié)

諾卡氏菌病潛伏期長(zhǎng)，發(fā)病前期無(wú)癥狀或癥狀不明顯，后期治愈率低，發(fā)病率高，發(fā)病病死率高，對(duì)魚(yú)類(lèi)危害大，給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害。臨床上，可根據(jù)魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病的流行特征及觀察體表、鰓絲、腹腔和內(nèi)臟的發(fā)病癥狀基本診斷該病。進(jìn)一步判斷要通過(guò)做細(xì)菌分離鑒定，確診后再做藥敏試驗(yàn)，這樣才能對(duì)癥用藥，達(dá)到良好治療效果[25]。水產(chǎn)動(dòng)物致病性諾卡氏菌的生物檢測(cè)技術(shù)已日益成熟，主要有PCR法和環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)法，通過(guò)DNA片段擴(kuò)增為陽(yáng)性，進(jìn)而診斷魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病，為魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病的早期快速檢測(cè)與防控提供有效的技術(shù)支持[29、37、39]。

目前對(duì)于魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病的防治仍以化學(xué)藥物為主，如四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考等，但存在對(duì)水體環(huán)境和危害人體健康等問(wèn)題，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部已將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁藥，且當(dāng)疾病發(fā)生后，一些敏感性抗生素也很難達(dá)到治療效果，同時(shí)也存在阿米卡星、新霉素、青霉素G、先鋒V等抗生素耐藥的問(wèn)題[31－32]。在生物藥方面，水產(chǎn)動(dòng)物諾卡氏菌病也進(jìn)行了疫苗方面的研究，無(wú)論是滅活疫苗還是弱毒疫苗效果都很有限，還沒(méi)有商品化疫苗可以使用[25、38]。迄今為止，尚未見(jiàn)到關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物諾卡氏菌病中草藥有效防治方面的報(bào)道，關(guān)于其抗菌的篩選方面的研究也很少[38、40]。

近年來(lái)，隨著漁業(yè)養(yǎng)殖疾病的暴發(fā)越來(lái)越頻繁，我國(guó)魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)受病害肆虐情況嚴(yán)重，患魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病魚(yú)的肝臟、腎臟等內(nèi)臟器官損傷較大，治愈難度相當(dāng)大，因此，對(duì)于該病的控制還是要“預(yù)防為主、防重于治”。此外，由于高效安全的漁藥很匱乏，諾卡氏菌的致病機(jī)制仍然不清楚，導(dǎo)致難以徹底治愈諾卡氏菌病。筆者在研究中草藥防治魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病中發(fā)現(xiàn)復(fù)方MY具有很好的效果，選取烏鱧（30～40 g）480條，鰤?mèng)~諾卡氏菌（攻毒感染），后分成四組高劑量組、中劑量組、低劑量組、空白組養(yǎng)在10 m3的魚(yú)缸中，6 d后當(dāng)烏鱧體表潰爛出血，肛門(mén)紅腫，解剖發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟（腎、脾、肝）白色結(jié)節(jié)增多等比較嚴(yán)重的癥狀后拌料進(jìn)行給藥。內(nèi)臟白色結(jié)節(jié)鏡檢可見(jiàn)大量短桿狀細(xì)菌，進(jìn)一步分離鑒定為鰤?mèng)~諾卡氏菌，結(jié)果：空白組全部死亡；復(fù)方MY高劑量組存活率100%；復(fù)方MY中劑量組存活率91%；復(fù)方MY低劑量組存活率42%，由此可見(jiàn)中藥在防治魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病是具有一定的效果。相關(guān)研究顯示，水產(chǎn)養(yǎng)殖用中草藥不會(huì)有抗生素殘留問(wèn)題。筆者期望后續(xù)的研究者應(yīng)加強(qiáng)中草藥防治魚(yú)類(lèi)諾卡氏菌病的研究，尤其是新藥的研發(fā)、中草藥資源的開(kāi)發(fā)，這將促進(jìn)水產(chǎn)綠色養(yǎng)殖的發(fā)展。

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