論文：斑點(diǎn)叉尾“腹水癥”病原的分離鑒定及體外芽孢桿菌拮抗試驗(yàn)

斑點(diǎn)叉尾“腹水癥”病原的分離鑒定及體外芽孢桿菌拮抗試驗(yàn)

王亞軍，魏文娟，潘厚軍，顏 曦，王 芳，石存斌

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380)

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

1.2 試劑與菌株材料

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白 (MH) 瓊脂、LB培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；5%羊血瓊脂培養(yǎng)基購自廣州市迪景微生物科技有限公司；革蘭染色試劑盒購自廈門邁威生物科技有限公司；細(xì)菌鑒定試劑條及相關(guān)配套試劑均購自法國梅里埃公司(BioMereux)；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；藥敏紙片為英國Oxid產(chǎn)品；基因測序由廣州艾基生物有限公司進(jìn)行。

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)Bl160913株、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Bs160913株、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)Bp160913株和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba160912株4株芽孢桿菌均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

1.3 病原菌的分離

將發(fā)病魚按常規(guī)方法剖檢，無菌條件下從病魚的肝臟、脾臟、腎臟等病灶組織取樣，分別在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和兔血瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑選大小形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落再純化，分離得到優(yōu)勢菌1株，轉(zhuǎn)接普通營養(yǎng)瓊脂平板，4 ℃保存?zhèn)溆肹9]。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 革蘭氏染色鑒定

無菌條件下在潔凈的載玻片上滴少許生理鹽水，用接菌環(huán)將分離純化后的單菌落均勻地涂布到盛有生理鹽水的載玻片上，待其自然風(fēng)干后，用結(jié)晶紫染液對其初染1 min，再用碘液媒染 1 min，后用脫色液脫色20～30 s，最后用番紅染色進(jìn)行復(fù)染1 min，鏡檢。

1.4.2 生化鑒定

按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]，根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果選用BioMereux ID 32 GN(革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條及配套試劑)，檢測優(yōu)勢菌株的生化特性[11]。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)DNA提取試劑盒說明提取優(yōu)勢菌株DNA。利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)16S rDNA基因擴(kuò)增所用引物和gyrB基因擴(kuò)增引物，16S rDNA上下游引物序列分別為：27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′，1492R ：5′GGTTACCTTGTTACGACTT 3′；gyrB上下游引物序列分別為：F:5’-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′，R:5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′ 。PCR反應(yīng)體系均為：上下游引物各1.0 μL，mix 11.0 μl，ddH2O 10.0 μL，DNA模板 2.0 μL。擴(kuò)增16S rDNA PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min 。擴(kuò)增gyrB PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、送廣州艾基生物技術(shù)公司測序，將所得到的gyrB DNA序列運(yùn)用NCBI的BLAST程序在Genbank進(jìn)行同源序列比對并利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[12-13]。

1.5 回歸感染

1.6 藥敏試驗(yàn)

將純化得到的細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃震蕩(200 r/min)培養(yǎng)4 h，用無菌生理鹽水稀釋菌液，達(dá)到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋侔?∶100稀釋菌液至含菌量約為1.5 × 106CFU /mL。混勻取100 μL至MH培養(yǎng)基平板中涂布均勻，其上放置藥敏紙片， 28 ℃培養(yǎng)20 h后測量不同藥物的抑菌圈直徑(mm)，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 文件標(biāo)準(zhǔn)判斷致病菌株對藥物的敏感程度[14 -16]。

1.7 芽孢桿菌的拮抗作用

分別將短小芽孢桿菌Bp160913株、枯草芽孢桿菌Bs160913株、地衣芽孢桿菌Bl160913株及解淀粉芽孢桿菌Ba160912株接種到裝有5.0 mL LB液體培養(yǎng)基試管中，37 ℃， 160 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，用無菌生理鹽水稀釋各菌液，均達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠞岫?。將分離純化的分離菌單菌落接種到裝有5.0 mL營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基試管中，置37 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)4 h后，用無菌生理鹽水稀釋菌液，達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠞岫?，取?0 μL稀釋100倍均勻涂布MH 平板，靜待一段時(shí)間后，其上放置牛津杯，輕輕加壓使其與培養(yǎng)基完全緊密結(jié)合，防止漏液，在牛津杯中加入150 μL不同種的芽孢桿菌培養(yǎng)液，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離與革蘭氏染色

圖1 菌株cw-1革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Gram staining results of strain cw-1

2.2 生化鑒定

菌株cw-1生理生化鑒定特性見表1， D-葡萄糖、脯氨酸、D-甘露醇等反應(yīng)呈陽性，而D-蜜二糖、肌醇和L-鼠李糖等反應(yīng)呈陰性，根據(jù)鑒定百分率(%id)為99.9，T(期望值)為0.88，以及無不符試驗(yàn)，初步鑒定分離菌株為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。

表1 分離菌株cw-1的生化特性Tab.1 Biochemical characteristics of cw-1 strains isolated from Ictalurus punctatus

注： “+”—陽性；“-”—陰性；d.75%陽性。

圖2 cw-1菌株16S rDNA基因PCR擴(kuò)增電泳圖 Fig.2 The PCR products for 16S rDNA gene of cw-1 strain

2.3 分子生物學(xué)鑒定

PCR擴(kuò)增cw-1的16S rDNA基因(圖2)，經(jīng)測序和Genbank比對，比對結(jié)果表明分離菌株cw-1屬于氣單胞菌類，相似度達(dá)到99%。對其gyrB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增的基因長度約為1 040 bp(圖3)。根據(jù)gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)菌株cw-1與溫和氣單胞菌的親緣關(guān)系最近，自然聚類為一支(圖4)，說明該菌株確為溫和氣單胞菌。

圖3 cw-1 gyrB基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 The PCR Products for gyrB Gene of cw-1 strain

圖4 cw-1菌株 gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of gyrB gene of cw-1 strain線長代表遺傳距離

2.4 回歸感染

表2 回歸感染結(jié)果Tab.2 Results of the recurrent infection

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過紙片擴(kuò)展法測試了菌株cw-1對10種常見藥物敏感性，具體結(jié)果見表3。菌株cw-1對恩諾沙星、氟苯尼考、氧氟沙星等6種藥物敏感，對磺胺復(fù)合藥物和鏈霉素中度敏感，而對四環(huán)素、強(qiáng)力霉素耐藥。

表3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of the drug sensitivity test

注： S—敏感 (直徑>17 mm)； I—中度敏感 (13 mm≤直徑≤17 mm)； R—不敏感(耐藥)(直徑<13 mm)

2.6 芽孢桿菌的拮抗結(jié)果

3 討論

溫和氣單胞菌屬弧菌科，革蘭氏陰性菌，是一種條件致病菌，分布廣泛，其主要致病因子包含腸毒素、溶血素等，感染后發(fā)病率高、發(fā)病迅速及死亡快[17]，常引起水生動(dòng)物大規(guī)模發(fā)病，是危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一[18]。本實(shí)驗(yàn)從患“腹水癥”的斑點(diǎn)叉尾上分離出的菌株為溫和氣單胞菌，此結(jié)果與韋昌用等[19]報(bào)道的腹水病病原一致，雖與鐘妮娜等[20]報(bào)道的腹水癥病原不同，與蘇應(yīng)兵等[2]報(bào)道的暴發(fā)性敗血癥病原也不完全一致，但發(fā)病斑點(diǎn)叉尾所表現(xiàn)出的“腹水”、眼球突出、內(nèi)臟腫大等癥狀相似。據(jù)以往的報(bào)道，高溫季節(jié)溫和氣單胞菌與嗜水氣單胞菌常單獨(dú)或者混合感染[21-22]，引起的癥狀也相似，這可能是本實(shí)驗(yàn)與以上報(bào)道的“腹水癥”病原存在不一致情況的原因。

表4 芽孢桿菌的拮抗作用Tab.4 Antagonism of Bacillus mm

注：牛津杯直徑7 mm

16S rDNA序列分析已成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法[23]，但這種細(xì)菌分析方法存在一定的局限性，只能在細(xì)菌屬的水平上區(qū)分。gyrB基因是一種可以編碼蛋白的基因，此基因存在于大多數(shù)細(xì)菌中，在細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)，特別是在近緣種和菌株的區(qū)分及鑒定方面受到高度關(guān)注[24,25]，Soler等[26]研究發(fā)現(xiàn)gyrB基因?qū)ο嘟姆N具有很高的分辨率，本實(shí)驗(yàn)先采用16S rDNA基因進(jìn)行分離菌株屬的鑒定，確定發(fā)病斑點(diǎn)叉尾其病原為氣單胞菌類，其后用gyrB基因擴(kuò)增鑒定菌株，進(jìn)一步確定菌株為溫和氣單胞菌。

根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，菌株對強(qiáng)力霉素和四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性，而對此實(shí)驗(yàn)中其他8種常用藥物均有敏感性，說明此養(yǎng)殖場尚未濫用藥物，在養(yǎng)殖過程中若發(fā)生此類細(xì)菌引起的疾病，可根據(jù)實(shí)際情況合理使用氟苯尼考等藥物治療，但要注意避免長期使用同一種藥物，以防病原菌產(chǎn)生耐藥性而導(dǎo)致防治無效[27]。由于抗生素濫用造成的弊端，近幾年生物防治和生態(tài)防治日漸興起[28]，據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌能分泌一種具有抑菌活性的抑菌物質(zhì)[29]，解淀粉芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌具有明顯的拮抗作用，將其作為益生菌添加劑添加到飼料中用于動(dòng)物生產(chǎn)，不僅有較好防病效果還可提高動(dòng)物生產(chǎn)性能[30-32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種芽孢桿菌對溫和氣單胞菌均有拮抗作用，但拮抗作用大小不同，地衣芽孢桿菌及解淀粉芽孢桿菌作用較為顯著，下一步應(yīng)定量分析芽孢桿菌拮抗溫和氣單胞菌的數(shù)量的關(guān)系，及其抗菌活性物質(zhì)及抗菌機(jī)理。

參考文獻(xiàn)：

[1]雷曉中,蔡焰值,汪 亮.斑點(diǎn)叉尾無公害高效養(yǎng)殖技術(shù)概要[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013,52(10):2377-2379.

[2]蘇應(yīng)兵,鄒桂偉,袁科平,等.斑點(diǎn)叉尾暴發(fā)性敗血癥病原的分離與鑒定[J].淡水漁業(yè)，2006,36(5):37-41.

[3]陳紅蓮,王永杰,陳 宇,等.患爆發(fā)性敗血癥斑點(diǎn)叉尾病原的分離與鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,41(1):24-29.

[4]劉 韜,王二龍,汪開毓,等.河南中牟地區(qū)斑點(diǎn)叉尾突發(fā)性敗血癥病原分離及鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2016,38(1):53-57.

[5]余曉麗,陳 明,李 超,等.斑點(diǎn)叉尾暴發(fā)性海豚鏈球菌病的研究[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008,23(3):185-191.

[6]鄧顯文，謝芝勛，劉加波，等.廣西斑點(diǎn)叉尾愛德華氏菌的分離鑒定[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,39(2):231-235.

[7]劉金玉,楊五名,李愛華,等.斑點(diǎn)叉尾套腸癥的病原學(xué)初步研究[J].水生生物學(xué)報(bào)，2008,32(6):824-831.

[8]楊移斌,劉天強(qiáng),陽 濤,等.斑點(diǎn)叉尾冬季大規(guī)模死亡病原分離與鑒定[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn),2016,6(6):53-58.

[9]耿 毅,汪開毓,陳德芳,等.斑點(diǎn)叉尾一株致病菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].微生物學(xué)報(bào),2006,46(4):649-652.

[10]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M] .北京:科學(xué)出版社，2001

[11]肖 寧,孔令嚴(yán),周 昊,等.克氏原螯蝦病原弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定及其藥敏與黏附特性[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2016,40(6):946-955.

[12]Theodore S，Coenye T，Vandamme P，et al.PCR-based assay for differentiation ofPseudomonasspecies from otherPseudomonasspecies recovered from Cystic Fibrosis Patients [J].J Clin Microbiol，2004,42(5):2074-2079.

[13] 遠(yuǎn) 方，屈淑平，崔崇士，等.一株新的胡蘿卜軟腐歐文氏菌的分離和鑒定[J].微生物學(xué)報(bào)，2004,44(2):136-140.

[14] Balouiri M，Sadiki M，Ibnsouda S K.Methods forinvitroevaluating antimicrobial activity:A review[J].J Pharm Anal ,2016,6(2):71-79

[15]胡大勝,黃 鈞,羅振海,等.廣西水產(chǎn)養(yǎng)殖主要細(xì)菌病的監(jiān)測與耐藥性調(diào)查[J].中國科技成果,2010,11(13) :49-51.

[16]鄭國興,周 凱.嗜水氣單胞菌歐洲鰻皮膚潰瘍分離株的耐藥性[J].中國水產(chǎn)科學(xué),1999，6 (3) :67-71.

[17]何長民.醫(yī)用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) [M].蘭州:甘肅人民出版社，1981.

[18]陳 瑞.抗嗜水氣單胞菌單克隆抗體和抗溫和氣單胞菌單克隆抗體的制備及鑒定 [D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2007.

[19]韋昌用,彭 亞,劉 杰,等.斑點(diǎn)叉尾腹水病病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,45(5):875-881.

[20]鐘妮娜,汪開毓,羅碧平,等.斑點(diǎn)叉尾“腹水癥”病原分離及免疫研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2002,38(9):40-41.

[21]唐江芳.氣單胞菌及其在水產(chǎn)中的危害[J].河北漁業(yè),2007(3):5-6,11.

[22]宋浩剛,吳亞峰,沈劍強(qiáng),等.南京某集貿(mào)市場淡水魚感染嗜水氣單胞菌的鑒定及毒力因子檢測[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2011，41 (2) :111-115.

[23]朱詩應(yīng)，戚中田.16S rDNA擴(kuò)增及測序在細(xì)菌鑒定與分類中的應(yīng)用[J].微生物與感染，2013,8(2):104-109

[24]侯曉麗,陳 智.分類及鑒別細(xì)菌的新靶標(biāo)-gyrB基因[J].國外醫(yī)學(xué)：流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊,2005,32(1):38-41.

[25]安 然,易圖永,肖啟明,等.gyrB基因在細(xì)菌分類和檢測中的應(yīng)用[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,(4):18-20，24.

[26]Soler L，Yanez M A.，Chacon M R.，et al.Phylogenetic analysis of the genus aeromonas based on two house keeping genes[J].Int J Syst Evol Micr，2004,54(5):1511-1519.

[27]陳昌福,毛芝娟,王 敏.福建愛德華氏菌對土霉素、氯霉素和鏈霉素的感受性、耐藥性研究[J].淡水漁業(yè)，1996，26 (3):3-6.

[28]陳 營,王福強(qiáng),王 凡.牙鲆腸道內(nèi)弧菌拮抗菌的分離與篩選[J].海洋科學(xué)，2003，27(3):43-46.

[29]Sugita H，Hirose Y，Matsuo N，et al.Production of the antibacterial substance byBacillussp.strain NM 12，an intestinal bacterium of Japanese coastal fish[J].Aquaculture,1998(3-4),165:269-280.

[30]曹海鵬,何 珊,劉麗玲,等.鱘源病原性嗜水氣單胞菌拮抗芽孢桿菌的鑒定及其生物學(xué)特性[J].微生物學(xué)通報(bào),2011,38(9):1377-1384.

[31]Kaewklom S，Lumlert S，Kraikul W，et al.Control ofListeriamonocytogeneson sliced bologna sausage using a novel bacteriocin,amysin,produced byBacillusamyloliqufaciensisolated from Thai shrimp paste (Kapi)[J],Food Control,2013,32(2):552-557.

[32]朱芝秀,蔣新華,鄧舜洲,等.解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其對嗜水氣單胞菌抑制作用研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2015,42(3):734-740.