鱘感染海豚鏈球菌組織病理學研究

鱘感染海豚鏈球菌組織病理學研究

文/王靜波 徐立蒲 劉建男 張文 呂曉楠 王小亮 曹歡 王姝

鱘魚是一種經濟價值很高的大型冷水經濟魚類。近年來，鱘魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，各種病害尤其是細菌性疾病日益嚴重，制約了鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。鏈球菌是一種條件性人畜共患病病原菌，可引起局部組織蜂窩織炎、心內膜炎及化膿性腦膜炎等。其中，海豚鏈球菌可感染多種海淡水魚類，引起魚類的腦膜炎和敗血癥。目前已有多例海豚鏈球菌感染西伯利亞鱘、施氏鱘和雜交鱘等引起暴發(fā)性疾病的報道，海豚鏈球菌已成為鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的重要威脅。為此，有必要開展鱘魚感染海豚鏈球菌后的病理損傷特征研究，探索海豚鏈球菌對鱘魚的致病機制，為鱘魚鏈球菌病的準確診斷和防治措施研究奠定基礎。

一、病原菌的鑒定與組織病理切片制作

（一）患病鱘

采自河北保定某鱘魚養(yǎng)殖場。

（二）病原分離與鑒定

取癥狀典型的患病鱘，無菌操作從肝、脾和腎劃線分離，于腦心浸液瓊脂（BHIA）平板和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h。

病原菌鑒定采用API鑒定系統(tǒng)和16S rDNA分子生物學方法。

（三）主要試劑和設備

腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、API 20 STREP鑒定試劑條、UNIQ-10柱式細菌基因組抽提試劑盒、PCR相關試劑；試驗試劑酸性分化液、二甲苯、無水乙醇、切片石蠟、樹膠、蘇木精、伊紅染液等；全自動脫水機、包埋機、冷凍機、切片機、烘片機。

（四）組織病理切片制作與觀察

取患病魚肝、腦、心、鰓、腎、脾和肌肉等組織于10%中性福爾馬林中固定。固定組織經酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和常規(guī)石蠟切片，切片厚度為4μm。切片經HE染色，中性樹膠封片，用Leica DM4000 LED 觀察并拍照記錄。

二、主要病理變化

（一）臨床癥狀

患病魚外觀主要癥狀為口周圍、腹部兩側骨板、肛門出血（圖1）。剖檢見部分試驗魚腹腔中有紅色血樣腹水；肝臟充血并有出血點（圖2）；脾臟腫大；腸道充血發(fā)紅，腸壁變薄，腸道積液；腎臟明顯腫大，出血呈紫黑色或嚴重糜爛不易剝離。

圖1 魚口周圍充血、腫脹

圖2 腹腔紅色血水、肝臟淤血、脾臟缺血

（二）病原分離鑒定

分離菌在BHIA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24h的菌落特征為：白色、圓形、邊緣齊整、扁平、直徑約0.3mm～0.5mm。在血瓊脂平板上28℃培養(yǎng)24h，菌落為圓形，中心白色，周邊半透明，形成β溶血環(huán)。氧化酶陰性，觸酶反應陰性，革蘭氏染色陽性，卵圓形，呈鏈狀或雙排鏈狀。

采用API 20 STREP 系統(tǒng)和PCR 16S rDNA 基因鑒定為海豚鏈球菌。

（三）組織病理學變化

組織病理檢查發(fā)現(xiàn)，試驗鱘魚呈全身性感染的敗血癥表現(xiàn)，各器官組織都有不同程度病變，尤以脾臟和腎臟的病理損傷最為嚴重。各器官組織的具體病理損傷情況如下。

腦：腦膜疏松，水腫增厚，并伴有毛細血管擴張淤血，有大量色素沉積（圖3A）；感染后期腦基質疏松、水腫呈海綿狀，神經元細胞腫脹，出現(xiàn)局灶性的液化性壞死（圖3B）。

圖3 雜交鱘海豚鏈球菌感染的組織病理學變化

肝：肝血竇擴張、淤血，肝靜脈淤血或缺血（圖3C）；肝細胞腫脹，彌漫性空泡變性，部分區(qū)域發(fā)生液化性壞死，感染后期有中性粒細胞和巨噬細胞浸潤（圖3D）。

脾：脾臟被膜水腫增厚甚至與實質剝離；脾組織嚴重淤血、出血，脾實質淋巴細胞被紅細胞取代，呈出血性壞死性脾炎。脾紅髓與白髓邊界模糊不清，結構不清；部分區(qū)域白髓壞死，淋巴細胞減少，組織疏松（圖3E）。感染后期脾被膜成片脫落，脾實質組織嚴重缺血，淋巴細胞大量減少、嗜酸性粒細胞顯著增多，部分區(qū)域出現(xiàn)嚴重的液化性壞死（圖3F）。

腎：整個腎臟組織缺血，腎間組織中紅細胞和淋巴細胞減少，部分區(qū)域出現(xiàn)液化性壞死導致腎間質疏松；腎間組織中嗜酸性粒細胞異常增多（圖3G）。腎小管上皮細胞腫脹、變性，甚至壞死脫落，腎小管上皮細胞透明滴狀變，嚴重時腎小管上皮細胞和腎小管管腔內可見大量均質紅染的蛋白質顆粒（圖3H）。

鰓：鰓組織病變較輕微，主要表現(xiàn)為鰓小片上皮細胞腫脹，毛細血管擴張，充血。

骨骼肌：肌肉組織病變較輕微，僅見肌纖維輕微變性腫脹。

三、結果與分析

在致病性鏈球菌中，海豚鏈球菌宿主范圍廣泛，可感染海淡水魚類和其他動物，是危害性強的人畜共患病病原和水產病原。目前，鱘魚海豚鏈球菌感染的病例日益增多，海豚鏈球菌已成為養(yǎng)殖鱘魚中危害大的細菌性病原之一。本研究發(fā)現(xiàn)，在患病鱘各器官組織中，脾臟和腎臟損傷最為嚴重，為主要的靶器官和組織。脾臟實質組織壞死、嚴重出血，淋巴細胞減少，呈出血性壞死性脾炎；腎臟則主要表現(xiàn)為腎間組織壞死，腎小管上皮細胞透明滴狀變，嗜酸性粒細胞增多；肝臟和腦組織可見液化性壞死灶，肝臟中有炎癥細胞浸潤。海豚鏈球菌感染不同宿主時會表現(xiàn)出不同癥狀，如引起海豚的多灶性皮下膿腫、人的蜂窩織炎、關節(jié)炎等，魚類則多表現(xiàn)為全眼球炎、腦膜炎和敗血癥。本研究發(fā)現(xiàn)，鱘魚海豚鏈球菌病的臨床癥狀與人、海豚等動物有較大差異，與其他魚類感染海豚鏈球菌較為相似，但未見到明顯的全眼球炎癥狀，這可能主要與宿主的種屬特異性有關。

魚類的脾臟和腎臟是重要的免疫器官。脾臟是機體免疫應答反應的主要場所，同時也具有造血功能，是紅細胞、各種粒細胞產生、儲存和成熟的主要場所。魚類的腎臟也具有造血功能，腎間組織中含有大量的免疫細胞，可以不依賴抗原刺激而產生相應的免疫細胞，是抵御外界病原入侵的直接防線。研究表明，海豚鏈球菌具有多個重要毒力基因，如cpsD（編碼莢膜多糖，能協(xié)助其逃避宿主細胞的清除作用）、simA（編碼M樣蛋白，能夠保護細菌免受巨噬細胞的吞噬，使免疫球蛋白失去免疫活性）和sagA（編碼溶血素，能夠破壞正常細胞的細胞膜，使宿主紅細胞發(fā)生溶血），這些毒力基因在細菌入侵、免疫逃避和體內增殖中發(fā)揮重要作用。感染海豚鏈球菌后，鱘魚脾臟和腎臟的嚴重病變提示海豚鏈球菌具有很強的毒力，可以突破脾臟和腎臟的免疫防御系統(tǒng)。脾臟和腎臟的損傷又進一步降低了鱘魚的防御能力，為細菌進一步大量增殖、形成全身感染、引發(fā)多組織器官損傷和敗血癥創(chuàng)造了條件。

許多報道表明，海豚鏈球菌可突破宿主的血腦屏障，引起魚類等多種動物的化膿性腦膜炎。本研究中患病鱘腦膜水腫增厚，有大量色素沉積，腦基質發(fā)生局灶性的液化性壞死，表明海豚鏈球菌可突破鱘的血腦屏障，引起腦膜炎。同時，在患病鱘腦組織中并未發(fā)現(xiàn)化膿性炎癥的標志——中性粒細胞的存在，這可能與感染濃度較大，病程較短有關，即細菌雖然突破了鱘的血腦屏障，但尚未在腦組織內大量增殖，也未來得及引起腦組織內中性粒細胞的大量浸潤以形成明顯的化膿病灶。此外，患病鱘肝細胞腫脹、空泡變性，部分區(qū)域發(fā)生液化性壞死并伴有中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，進一步證實海豚鏈球菌可引起鱘魚多器官損傷，以及化膿性炎癥。本研究還發(fā)現(xiàn)，感染海豚鏈球菌后，鱘肝臟和腎臟中嗜酸性粒細胞顯著增多，這可能與魚體清除病原、抗感染有關。嗜酸性粒細胞是動物機體重要的免疫防御細胞，在抗細菌、寄生蟲和變態(tài)反應中發(fā)揮重要作用。脾臟和腎臟組織中嗜酸性粒細胞大量增殖，在殺傷細菌的同時，也會進一步促進炎癥進展，損傷組織并最終引起多器官損傷。