一種雷氏放射孢子蟲的鑒定及其特征描述

一種雷氏放射孢子蟲的鑒定及其特征描述

翟艷花1,2周 莉1桂建芳1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

放射孢子蟲(Actinosporean)是黏體動物在其中間宿主水生無脊椎動物體內(nèi)的一個生活階段。研究鑒定并描述了一種雷氏放射孢子蟲的形態(tài)和分子特征。該放射孢子蟲的主要形態(tài)結(jié)構(gòu)是: 由三個極囊、內(nèi)含孢原質(zhì)的孢子體和三個尾突組成, 無孢柄。極囊位于孢子體頂端, 呈梨形, 長5.2 μm, 寬2.9 μm; 孢子體側(cè)面觀呈長橢圓形, 長16.4 μm, 寬9.5 μm; 三個尾突基本等長, 呈錨狀, 平均長度102.6 μm, 寬9.54 μm, 尾突末端輕微的上翹。每個尾突遠(yuǎn)側(cè)端表面有許多形狀不規(guī)則的棘狀小刺。18S rDNA序列比對表明, 該雷氏放射孢子蟲與國外已報道的Myxobolus cultus 18S rDNA序列一致性最高, 達(dá)98.41%, 由此推測該雷氏放射孢子蟲可能為M. cultus的對應(yīng)放射孢子蟲階段。研究豐富了國內(nèi)放射孢子蟲的基礎(chǔ)研究。

黏體動物; 雷氏放射孢子蟲; 蘇氏尾鰓蚓

黏體動物(Myozoans)是一類多細(xì)胞、形成孢子的后生動物寄生蟲, 廣泛寄生于多種重要的經(jīng)濟(jì)魚類, 迄今已報道了2180種[1]。黏孢子蟲幾乎能在魚體的所有器官中寄生, 可奪取宿主營養(yǎng)、分泌可溶解宿主組織的酶以及造成機(jī)械性損傷與壓迫等傷害,輕者影響魚體生長發(fā)育, 使商品魚喪失應(yīng)有的價值,重者可直接造成感染魚的大量死亡, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)影響[2—4]。

放射孢子蟲(Actinosporean), 原隸屬于黏體動物門(Phylum Myxozoa)放射孢子蟲綱(Class Actinomyxidia), 首次被Stolc[5]作為一種寄生于無脊椎動物體內(nèi)的寄生蟲被記錄之后, 曾長期被認(rèn)為是黏體動物門下的一個獨(dú)立的生物種群。1984 年, Wolf 和Markiw對引起虹鱒“旋轉(zhuǎn)病”(Whirling disease, WD)病原體腦黏體蟲(M. cerebralis)的生活史進(jìn)行了研究,首次證實腦黏體蟲的生活史包括魚和寡毛類(Tubifex tubifex)兩個宿主, 放射孢子蟲只是黏體動物在水生無脊椎動物體內(nèi)的一個生活階段[6]。從此,國際上將原隸屬于黏體動物門下的放射孢子蟲綱取消, 將其中的各類型放射孢子蟲物種暫時以“組合群”(Collect groups)作為過渡分類單位而歸入黏孢子蟲綱[1,7]。由于放射孢子蟲對宿主個體的強(qiáng)感染力引起了廣大研究者的重視。各國學(xué)者對放射孢子蟲展開了多方面的研究, 主要涉及放射孢子蟲新類型的鑒定、超微結(jié)構(gòu)觀察、系統(tǒng)發(fā)育等[8—10]。但我國開展的相關(guān)研究較少, 除了王桂堂和姚衛(wèi)建[11]鑒定的一種三突放射孢子蟲以及我們鑒定的另一種新的三突放射孢子蟲類型[12]之外, 未見其他相關(guān)文獻(xiàn)報道。

異育銀鯽是近十多年來養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖產(chǎn)量穩(wěn)步持續(xù)增長的淡水養(yǎng)殖魚類之一, 近年來與其他鯽魚一起年總產(chǎn)量已突破200萬噸, 產(chǎn)值近300多億元, 在淡水養(yǎng)殖中占據(jù)十分重要的地位[13,14]。目前,寄生蟲病, 尤其是黏孢子蟲病引起的病害已成為制約鯽魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素[15—17]。調(diào)查并鑒定放射孢子蟲或黏孢子蟲將有助于鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。因此, 我們對位于武漢蔡甸實驗基地內(nèi)常年暴發(fā)黏孢子蟲病的異育銀鯽養(yǎng)殖池塘進(jìn)行了連續(xù)的調(diào)查研究, 采集池塘底泥中的水生環(huán)節(jié)動物,對其釋放出的放射孢子蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子學(xué)研究。本研究報道其中鑒定的一種雷氏放射孢子蟲的形態(tài)特征, 同時18s rDNA序列比對結(jié)果顯示, 該雷氏放射孢子蟲為寄生于鯽魚鰓軟骨組織的Myxobolus cultus的對應(yīng)放射孢子蟲階段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

水棲寡毛類樣品于2009年采自本實驗室位于湖北省武漢市蔡甸區(qū)的魚類遺傳育種實驗基地。采樣地點(diǎn): 以異育銀鯽為主要養(yǎng)殖魚類的土質(zhì)池塘和水泥塘間的排水溝。

1.2 實驗方法

水棲寡毛類的采集和物種鑒定 池塘底泥的采集使用1/16 m2良的彼得生(Petersen)采泥器, 池塘邊緣水淺的地方可直接用鐵鍬挖取, 排水溝內(nèi)的樣品直接用小鏟子挖取。底泥樣品經(jīng)60目的銅篩清洗后, 裝入2000 mL的燒杯中運(yùn)回實驗室。在實驗室內(nèi), 將容器內(nèi)的泥沙水倒入白瓷盤內(nèi), 待泥沙沉淀后, 肉眼狀態(tài)下用彎頭鑷子將白瓷盤內(nèi)的水蚯蚓輕輕挑出, 放入直徑為12 cm玻璃培養(yǎng)皿中。分別用單蒸水和雙蒸水清洗3次之后, 置于超純水中室溫條件下暫養(yǎng)3—5d。水棲寡毛類物種的鑒定根據(jù)中國動物志分類手冊和《中國小蚓類研究》進(jìn)行鑒定[18]。

放射孢子蟲的收集 參照Yokoyama, et al.[19]提供的方法, 將形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的水蚯蚓放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 每個細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加2 mL的雙蒸水。然后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入4℃房, 每隔兩天用Zeiss Axiovert 200立體顯微鏡檢查一次, 觀察放射孢子蟲的釋放情況。細(xì)胞培養(yǎng)板中的水每兩天更換一次。當(dāng)觀察到有放射孢子蟲釋放出來時, 將該陽性細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的水收集至1.5 mL的離心管內(nèi), 離心收集放射孢子蟲。

放射孢子蟲的形態(tài)學(xué)測量 新鮮釋放出來的放射孢子蟲, 置于光學(xué)顯微鏡下放大倍數(shù)觀察, 利用校準(zhǔn)目鏡測微尺(分劃板)并參照Lom, et al.[20]提供的測量方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)測量。圖片用Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡上配置的數(shù)碼相機(jī)拍攝。

18S rDNA的PCR擴(kuò)增 實驗所用引物為魯義善[3]設(shè)計的引物: myxoF(5′-CGCGGTAATTCCA GCTCCAGTAG-3′)和myxoR (5′-ACCAGGTAAGTT TTCCCGTGTGA-3′)。吸取新鮮釋放的放射孢子蟲,滴在經(jīng)過高壓滅菌處理的載玻片上, 置于倒置顯微鏡下, 用毛細(xì)玻璃管小心分離出單個蟲體。經(jīng)滅菌雙蒸水洗3次, 每4個蟲體為一組, 放入含3 μL滅菌水的PCR管中。13000—16000 r/m離心10s, 先加入5 μL的細(xì)胞裂解液, 再滴入10 μL的礦物油防止水分蒸發(fā)。將PCR管放置于PCR儀中55℃溫育1h, 99℃熱變性20min, 變性后將PCR管迅速放在冰上, 降至室溫, 最后加入15 μL 的PCR反應(yīng)液, 使最終的總反應(yīng)體系為25 μL。每組設(shè)一管空白對照(用清洗過放射孢子蟲的水作為空白對照)。PCR反應(yīng)條件: 94℃ 預(yù)變性2min; 94℃變性1min, 53℃退火50s, 72℃延伸1min30s, 循環(huán)35次; 72℃末端加尾10min; 4℃暫存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、回收、并克隆到pMD18-T 載體中, 轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌, 培養(yǎng)過夜, PCR 篩選陽性克隆, 測序。

細(xì)胞裂解液的配制(1000 μL 體系): 10×PCR buffer 100 μL; 25 mmol/L MgCl280 μL; 10 mmol/L proteinase K 30 μL; 滅菌水790 μL。

PCR反應(yīng)液的配制: 10×PCR buffer 0.5 μL; MgCl2(25 mmol/L)1.4 μL; dNTP (10 mmol/L)0.5 μL;正向引物(10 μmol/L)1 μL; 反向引物(10 μmol/L)1 μL; Taq DNA polymerase 0.125 μL; 0.475 μL 滅菌水。

18S rDNA的序列分析 登錄NCBI, 用BLAST-N程序 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)對測序結(jié)果進(jìn)行同源性檢索。使用Clustal-X進(jìn)行序列的多重比對, 分析序列的一致性[21]。

2 結(jié)果

2.1 水棲寡毛類物種鑒定

水棲寡毛類經(jīng)鑒定均為: 尾鰓蚓屬(Branchiura)蘇氏尾鰓蚓(Branchiura sowerbyi Beddard, 1892)。

2.2 放射孢子蟲的釋放

2009年采集的538條蘇氏尾鰓蚓樣品中, 僅有一條在4℃培養(yǎng)條件下的第8天釋放出成熟的放射孢子蟲。

2.3 放射孢子蟲的形態(tài)描述

寄主蘇氏尾鰓蚓體內(nèi)釋放出的放射孢子蟲為雷氏放射孢子蟲, 具有明顯的“三支架”錨狀形態(tài), 隨機(jī)選取其中15個新鮮蟲體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和數(shù)據(jù)測量(表1)。雷氏放射孢子蟲的整體形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖1):主要由3個極囊(Polar capsule)、內(nèi)含孢原質(zhì)(Sporoplasm)的孢子體(Spore body)和3個尾突(Caudalprocesses)組成, 無孢柄。孢子體側(cè)面觀呈長橢圓形,平均長16.4 μm, 寬9.5 μm; 孢原質(zhì)側(cè)面觀呈卵圓形; 3個大小均等的極囊位于孢子體頂端, 極囊呈梨形,平均長5.2 μm, 寬2.9 μm; 3個尾突基本等長, 平均長度為102.6 μm, 寬為4.7 μm; 尾突末端輕微的上翹。有趣的是, 當(dāng)放大倍數(shù)觀察時, 可明顯見每個尾突的遠(yuǎn)側(cè)端表面有許多細(xì)小的、形狀不規(guī)則的棘狀小刺, 靠近末端部尤為明顯(圖1C、D)

表1 雷氏放射孢子蟲的形態(tài)學(xué)測量數(shù)據(jù)Tab. 1 Measurements of the live Raabiea type actinospore which released from oligochaete in present study (n=15)

圖1 雷氏放射孢子蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1 Morphological observation of Raabeia type actinospore

2.4 18S rDNA的序列分析

以放射孢子蟲為模板, 利用引物myxoF和myxoR擴(kuò)增到了長度為753 bp的18S rDNA序列。該雷氏放射孢子蟲與國外報道的M. cultus (AB121146)序列一致性最高(98.41%); 與國內(nèi)報道的Raabeia sp. BWX(HQ613408)和M. cultus (HQ613409)的一致性次之, 分別為98.26%和98.14%; 與國內(nèi)報道的M. lentisuturalis (AY119688)之間一致性為96.55%。

2.5 小結(jié)

類型: 雷氏放射孢子蟲 (Raabeia type)

寄主: 蘇氏尾鰓蚓 Branchiura Sowerbyi Beddard 1892

采集地: 湖北, 武漢, 蔡甸區(qū)

感染率: 0.18%

在放射孢子蟲類群的鑒定中, 孢子體的形狀,孢柄的有無及尾柄形狀特征等都是非常重要的鑒定依據(jù)。本文描述的放射孢子蟲孢體呈橢圓形, 無孢柄, 尾柄近鄰孢體后端向后側(cè)延伸并稍微上翹, 呈典型的錨狀形態(tài)。這些形態(tài)特征為雷氏放射孢子蟲的主要特征, 因此我們將該放射孢子蟲歸為雷氏集合群(Raabeia collect group)。此外, 尾突末端放大倍數(shù)觀察, 每個尾突的遠(yuǎn)側(cè)端表面有許多形狀不規(guī)則的棘狀小刺, 此特征在所報道的雷氏放射孢子蟲中是少見的(圖1C、D)。

3 討論

繼Wolf和Markiw 的開創(chuàng)性工作之后, 作為黏孢子蟲在中間宿主體內(nèi)生活階段的各類型放射孢子蟲陸續(xù)地被研究者報道。在已報道的200多種放射孢子蟲中(19個組合群), 雷氏放射孢子蟲(Raabeia type)有29種, 占總數(shù)的14.5%。表2中列出了已報道的雷氏放射孢子蟲[22—34]。當(dāng)雷氏放射孢子蟲隨著寡毛類動物的糞袋排出體外進(jìn)入水體后, 在水體內(nèi)的錨狀形態(tài)結(jié)構(gòu)和無孢柄的特性使其與其他類型的放射孢子蟲如桔瓣放射孢子蟲(Aurantiactionmyxon)、合放射孢子蟲(Synactionmyxon)和三突放射孢子蟲(Triactinomyxon)等很容易區(qū)別開來。

本文描述的雷氏放射孢子蟲與Hallett, et al.[32]報道的雷氏放射孢子蟲 R. type 2的外觀形態(tài)最為接近(表2), 兩者之間尾突長度差距最小(102.6 μm vs. 120.7 μm), 只是R. type 2的孢子體較長較寬些(22 μm×14.2 μm vs. 16.3 μm×9.5 μm), 極囊近圓形,而本文報道的雷氏放射孢子蟲極囊近梨形(4.2 μm×3.6 μm vs. 5.2 μm×2.87 μm)。另外, 當(dāng)放大倍數(shù)觀察尾突末端時, 可觀測到尾突的遠(yuǎn)側(cè)端表面有許多形狀不規(guī)則的棘狀小刺, Hallett, et al.[32]報道的雷氏放射孢子蟲 R. type 2沒有該特征。只有?zer, et al.[29]報道的雷氏放射孢子蟲R. type 4的尾突后末端具有狀小刺結(jié)構(gòu)。但是, 與本研究鑒定的雷氏放射孢子蟲相比, R. type 4的尾突較長(142.7 μm vs. 102.7 μm), 孢子體較大(29.6 μm×16.5 μm vs. 16.3μm×9.5μm),極囊也較大(6.3 μm×6.4 μm vs. 5.2 μm×2.87 μm), 而且孢子體形態(tài)偏圓形, 而本文報道的孢子體為橢圓形。

關(guān)于放射孢子蟲尾突末端的不規(guī)則棘狀物, 除了?zer, et al.[29]報道的雷氏放射孢子蟲R. type 4之外, 在Marcucci, et al.[35]報道的棘放射孢子蟲(Echinactinomyxon)和Hallett, et al.[36]報道的合放射孢子蟲(Hexactionmyxon)中也有描述。Hallett, et al.的研究發(fā)現(xiàn), 合放射孢子蟲尾突末端的棘狀物, 非常容易黏附培養(yǎng)基(或水體)中的碎片, 而且這種合放射孢子蟲在靜置狀態(tài)下, 是沉于培養(yǎng)基底部的,在攪拌培養(yǎng)基后, 才會暫時地浮現(xiàn)于上層。因此Hallet, et al.認(rèn)為, 放射孢子蟲能利用尾突末端的棘突黏附水中雜物來增加自身重量, 降低在水體中的浮力, 不至于漂浮在水體的表面, 從而增大與水體中宿主魚的接觸機(jī)會, 增強(qiáng)感染宿主的幾率[36]。作者認(rèn)為, 尾突末端的不規(guī)則小棘突, 除了上述功能之外, 可能還有利于增強(qiáng)放射孢子蟲與寄主體表的接觸面積, 或者說當(dāng)與寄主體表接觸時, 棘突有利于孢子蟲更好地黏附于寄主體表, 有利于原始感染性胚質(zhì)細(xì)胞向寄主體內(nèi)的釋放。

除了形態(tài)特征比較的差異之外, 不同類型的雷氏放射孢子之間也存在寄主偏好性差異。從表2中還可以看出, 在已報道的29種放射孢子蟲中, 有4種是寄生于顫蚓科(Tubificidae)的尾鰓蚓屬(Branchiura), 分別是R. type of M. cultus[34]、R. type of M. lentisuturalis[33]、R. type 1 of EL-Mansy 和R. type 2 of EL-Mansy[27]。而其他種類的雷氏放射孢子蟲則多寄生于顫蚓科的正顫蚓(T. tubifex)、霍甫水絲蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)以及蠕蟲(L. variegatus)。本文描述的雷氏放射孢子蟲的寄主經(jīng)鑒定為尾鰓蚓屬的蘇氏尾鰓蚓。

通過部分18S rDNA序列比對, 本文報道的雷氏放射孢子蟲與國外研究報道的M. cultus (AB121146)和國內(nèi)上傳至NCBI上的M. cultus (HQ613409)的序列一致性都在98%以上。目前, 盡管還沒有制訂出廣為接受的遺傳距離標(biāo)準(zhǔn)與域值來明確區(qū)別種類間的界限范圍, 但是, 從已發(fā)表的幾篇研究論文來看,一致性在98%以上的, 基本被認(rèn)定為同一物種, 其差異值是由于寄生于不同的寄主或地理位置不同所造成的[37—41]。Yokoyama, et al.[34]通過感染實驗證實M. cultus的對應(yīng)放射孢子蟲為雷氏放射孢子蟲,因此, 我們將本研究鑒定的雷氏放射孢子蟲與Yokoyama, et al.報道的雷氏放射孢子蟲R. type of M. cultus的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較: 兩者之間最大的差別在于, 本文鑒定的雷氏放射孢子蟲尾突末端有細(xì)小的棘突, 孢子體近橢圓形; 而R. type of M. cultus有較長的尾突(204 μm vs. 102.6 μm), 孢子體較長較窄(21 μm×8 μm vs. 16.3 μm×9.5 μm), 更接近于長圓形。Holzer, et al.的研究表明, 來源于不同寄主體內(nèi)的放射孢子蟲, 即使是基因型相同的同一物種, 為了適應(yīng)不同的生長環(huán)境, 在表型上會存在少許的形態(tài)差異[42]。因此, 我們認(rèn)為本文描述的雷氏放射孢子蟲可能為M.cultus的對應(yīng)放射孢子蟲階段。本研究豐富了國內(nèi)放射孢子蟲的基礎(chǔ)研究。