溫度對(duì)中型指環(huán)蟲(chóng)產(chǎn)卵和孵化的影響

溫度對(duì)中型指環(huán)蟲(chóng)產(chǎn)卵和孵化的影響

張效平 李文祥 艾桃山 吳山功鄒 紅 王桂堂

(1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;3.武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司, 武漢 430207)

隨著魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖密度的提高和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化,單殖吸蟲(chóng)病的發(fā)生日益頻繁和嚴(yán)重, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。單殖吸蟲(chóng)一般寄生于魚(yú)類(lèi)的鰓和體表, 以其后吸器的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)插入魚(yú)類(lèi)組織,破壞鰓及皮膚[3], 可刺激鰓細(xì)胞分泌過(guò)多黏液, 引起鰓絲黏連和壞死, 影響?hù)~(yú)類(lèi)呼吸[4],也可破壞魚(yú)類(lèi)體表組織, 引起細(xì)菌、真菌和病毒的繼發(fā)性感染, 導(dǎo)致魚(yú)苗甚至成魚(yú)的大量死亡[5]。

中型指環(huán)蟲(chóng)(Dactylogyrus intermedius)是寄生于鯽(Carassius auratus)、鯉(Cyprinus carpio)鰓部一種較常見(jiàn)的單殖吸蟲(chóng), 分布廣泛, 在國(guó)內(nèi)外均有發(fā)現(xiàn)和報(bào)道[6—8]。近年來(lái), 國(guó)內(nèi)外的一些學(xué)者研究了中草藥提取物對(duì)中型指環(huán)蟲(chóng)的殺滅效果[9—11], 但是還沒(méi)有中型指環(huán)蟲(chóng)生活史方面的研究報(bào)道。由于單殖吸蟲(chóng)生活史的每一階段都極大的受制于溫度, 其產(chǎn)卵、孵化和纖毛幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育速度與溫度密切相關(guān)[12,13]。本實(shí)驗(yàn)將以金魚(yú)(Carassius auratus)鰓部的中型指環(huán)蟲(chóng)為研究對(duì)象, 研究在離體條件下溫度對(duì)中型指環(huán)蟲(chóng)產(chǎn)卵和孵化的影響。這將為研究有效的生態(tài)控制技術(shù)和藥物防治方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)

實(shí)驗(yàn)魚(yú)購(gòu)自武漢市武昌區(qū)八一路花鳥(niǎo)市場(chǎng), 將金魚(yú)養(yǎng)在盛有曝氣自來(lái)水的水族箱中。

1.2 中型指環(huán)蟲(chóng)的收集

用MS-222將金魚(yú)麻醉后, 剪下鰓片, 放在載玻片上, 在解剖鏡下進(jìn)行觀(guān)察。當(dāng)發(fā)現(xiàn)指環(huán)蟲(chóng)時(shí), 迅速將其剝離下來(lái), 立即放到盛有少量曝氣自來(lái)水的 24孔板中, 并對(duì)指環(huán)蟲(chóng)進(jìn)行清洗。在倒置顯微鏡下觀(guān)察指環(huán)蟲(chóng)的形態(tài)特征, 如果指環(huán)蟲(chóng)蟲(chóng)體的體長(zhǎng)在0.24—0.38 mm, 中央大鉤較短, 鉤尖平直, 其基部的背葉和腹葉分叉明顯, 背葉較短, 聯(lián)接棒單一,交配管呈斜管狀, 基部較寬, 且?guī)в谢鵞14], 可鑒定為中型指環(huán)蟲(chóng), 并將收集到的蟲(chóng)體用來(lái)產(chǎn)卵和孵化實(shí)驗(yàn)。

1.3 中型指環(huán)蟲(chóng)的產(chǎn)卵

將收集的中型指環(huán)蟲(chóng)放到盛有曝氣自來(lái)水的24孔板中, 一孔一蟲(chóng), 分別置于 10、22、30、35℃的生化培養(yǎng)箱和4℃的冰箱內(nèi), 前5h內(nèi)每隔1h取出觀(guān)察一次, 之后每2h觀(guān)察一次, 記錄每條指環(huán)蟲(chóng)產(chǎn)卵的數(shù)量, 直至蟲(chóng)體死亡或連續(xù) 12h沒(méi)有產(chǎn)卵時(shí)實(shí)驗(yàn)終止。

1.4 蟲(chóng)卵的孵化

收集到中型指環(huán)蟲(chóng)產(chǎn)下的蟲(chóng)卵, 放到盛有曝氣自來(lái)水的24孔板中, 分別置于10、22、30、35℃的生化培養(yǎng)箱和 4℃的冰箱內(nèi), 在眼點(diǎn)出現(xiàn)之前每隔12h取出觀(guān)察一次, 當(dāng)出現(xiàn)眼點(diǎn)后每 2h觀(guān)察一次,記錄蟲(chóng)卵的變化情況, 直到所有蟲(chóng)卵都孵化或變黑死亡, 實(shí)驗(yàn)終止。

1.5 數(shù)據(jù)處理

在各溫度下產(chǎn)卵數(shù)量的顯著性檢驗(yàn)采用單因素的方差分析(ANOVA), 孵化率采用卡方檢驗(yàn), 統(tǒng)計(jì)分析用軟件SPSS 13.0。

2 結(jié)果

2.1 中型指環(huán)蟲(chóng)的產(chǎn)卵

產(chǎn)卵過(guò)程 在實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到, 蟲(chóng)卵形成很快,當(dāng)將中型指環(huán)蟲(chóng)移入盛有曝氣自來(lái)水的 24孔板后,第一枚卵在1min之內(nèi)就可排出。第一枚卵排出后大約 2min, 另一枚卵在后面接著開(kāi)始形成, 在顯微鏡下可以清楚地看到卵粒的形成和增大的過(guò)程。在蟲(chóng)卵形成過(guò)程中, 蟲(chóng)體做波浪狀的收縮和舒張運(yùn)動(dòng),蟲(chóng)卵越來(lái)越大, 大約6、7min后蟲(chóng)卵完全成熟, 排出體外。但是后面蟲(chóng)卵的形成時(shí)間和產(chǎn)卵過(guò)程越來(lái)越長(zhǎng)。

卵的形態(tài) 在所觀(guān)察的正常卵中(能夠孵化出纖毛幼蟲(chóng)的卵), 除了小部分為圓形, 大部分為梨形, 長(zhǎng)約 30 μm; 蟲(chóng)卵顏色較深, 后端有一個(gè)卵柄;蟲(chóng)體最后產(chǎn)出的幾枚蟲(chóng)卵, 形狀一般不規(guī)則, 顏色較淺, 近透明, 大小不一, 一般小于正常卵, 而且卵殼較薄, 容易破裂, 這些非正常卵不能孵化出幼蟲(chóng)(圖 1)。

圖1 中型指環(huán)蟲(chóng)在離體條件下所產(chǎn)的正常卵(左)與非正常卵(右)Fig.1 Normal (left) and abnormal (right) egg of Dactylogurus intermedius

溫度對(duì)中型指環(huán)蟲(chóng)產(chǎn)卵的影響 在 4℃條件下, 大部分中型指環(huán)蟲(chóng)直到死亡也不產(chǎn)卵。只有少數(shù)已懷有發(fā)育完全的卵粒的中型指環(huán)蟲(chóng)會(huì)產(chǎn)一枚卵。在此溫度條件下, 中型指環(huán)蟲(chóng)成蟲(chóng)最長(zhǎng)存活時(shí)間為9d。

在 10—35℃溫度范圍內(nèi), 平均產(chǎn)卵量隨著溫度的升高而增加, 其平均產(chǎn)卵量分別為 3.30、4.10、4.13和 4.24枚/蟲(chóng)(圖 2), 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示： 在 35℃條件下的產(chǎn)卵量明顯高于10℃(P< 0.05), 其他溫度條件下的平均產(chǎn)卵量沒(méi)有顯著性差異; 中型指環(huán)蟲(chóng)的產(chǎn)卵速率隨著溫度的升高而加快, 產(chǎn)卵維持的時(shí)間分別為4d、23h、15h和11h。

圖2 不同溫度條件下中型指環(huán)蟲(chóng)的平均產(chǎn)卵量(n代表中型指環(huán)蟲(chóng)的數(shù)量)Fig.2 Mean egg production of Dactylogyrus intermedius at 10℃,22℃, 30℃ and 35℃ (n represents the number of D.intermedius examined)

2.2 中型指環(huán)蟲(chóng)蟲(chóng)卵的孵化

圖3 中型指環(huán)蟲(chóng)蟲(chóng)卵在孵化過(guò)程中的變化Fig.3 Stages of Dactylogyrus intermedius in egg hatching

蟲(chóng)卵的孵化過(guò)程 剛排出的蟲(chóng)卵為灰黑色, 當(dāng)蟲(chóng)卵在 22℃孵育 24h后, 開(kāi)始出現(xiàn)黑色眼點(diǎn)(圖 3a)。在孵育2d后, 纖毛幼蟲(chóng)的輪廓明顯, 還可看到纖毛幼蟲(chóng)后吸盤(pán)上的小鉤(圖 3b)。有時(shí)可見(jiàn)蟲(chóng)體在卵殼內(nèi)蠕動(dòng), 以頭部頂卵殼上的卵蓋。大約在孵化 96h后, 大部分幼蟲(chóng)頂破卵蓋而成功鉆出, 留下一個(gè)空殼(圖 3c)。有些幼蟲(chóng)在蠕動(dòng)的過(guò)程中, 頭部偏離了卵蓋的位置, 無(wú)法從卵蓋處鉆出, 而是從中間或后端頂開(kāi)一個(gè)洞而鉆出。還有一部分幼蟲(chóng)在鉆出的過(guò)程中, 只有頭部鉆出卵殼而身體后端卻被卡在卵殼內(nèi), 造成死亡。沒(méi)有鉆出卵殼的纖毛幼蟲(chóng)則死亡, 慢慢變黑。

纖毛幼蟲(chóng)的形態(tài) 剛孵化出的纖毛幼蟲(chóng)呈圓筒狀, 兩端稍尖, 兩對(duì)眼點(diǎn)大而清晰; 后吸盤(pán)具有若干對(duì)小錨鉤, 且小錨鉤在不停地做伸縮運(yùn)動(dòng), 大錨鉤收縮在體內(nèi); 纖毛幼蟲(chóng)具有三環(huán)纖毛, 分別分布在前部、中部和尾部(圖4), 纖毛不停地在水中擺動(dòng), 纖毛幼蟲(chóng)有時(shí)靜止在某一水層, 有時(shí)又非?；钴S, 時(shí)而急速前行, 時(shí)而做“8”字形運(yùn)動(dòng), 并不時(shí)地以頭器與孔壁接觸。

溫度對(duì)中型指環(huán)蟲(chóng)孵化的影響 在 4℃條件下, 中型指環(huán)蟲(chóng)蟲(chóng)卵不能孵化, 但是將蟲(chóng)卵放在 4℃條件下保存一周后, 再取出放在室溫(約 27℃)下, 蟲(chóng)卵能成功孵化,且孵化率達(dá)到60%。

圖4 剛孵化的纖毛幼蟲(chóng)的形態(tài)Fig.4 Morphology of newly hatched oncomiracidia of Dactylogyrus intermedius

在 22℃條件下, 中型指環(huán)蟲(chóng)的孵化率最高,為 72.7%, 其次是 10℃,而在30℃和35℃條件下的孵化率最低, 約 50%(圖5)?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示 4種溫度條件下的孵化率無(wú)顯著差異(P>0.05)。隨著溫度的升高,蟲(chóng)卵的孵化速度明顯增加, 即孵化的時(shí)間逐漸減少, 在 10℃下, 中型指環(huán)蟲(chóng)卵最快需要 24d才能孵化, 在 22℃下, 蟲(chóng)卵在第2d即開(kāi)始出現(xiàn)眼點(diǎn), 3d后開(kāi)始孵化, 而當(dāng)溫度升至30℃和 35℃時(shí), 蟲(chóng)卵的平均孵化時(shí)間也分別降至42h和26h。纖毛幼蟲(chóng)最長(zhǎng)存活時(shí)間隨著溫度的升高而減少, 在 4個(gè)溫度條件下的最長(zhǎng)存活時(shí)間分別為4d、3d、56h 和 34h。

3 討論

3.1 離體條件下卵的形態(tài)和產(chǎn)卵速率以及溫度對(duì)產(chǎn)卵速率的影響

在離體條件下, 中型指環(huán)蟲(chóng)最后產(chǎn)出的幾枚卵在大小、形狀和顏色等特征上與正常卵差距明顯,而且不能孵化出幼蟲(chóng)。卵的形成需要消耗蟲(chóng)體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 而在離體條件下, 隨著蟲(chóng)卵不斷的形成和排出, 成蟲(chóng)體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗, 由于得不到充足的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充, 最后形成的幾枚卵由于營(yíng)養(yǎng)不足, 而出現(xiàn)異常。另外, 該指環(huán)蟲(chóng)前幾枚卵的排出速率較快, 只需要幾分鐘, 而后面的產(chǎn)卵速率越來(lái)越慢,這應(yīng)該與指環(huán)蟲(chóng)在離體條件下的應(yīng)激產(chǎn)卵有關(guān)[15]。在魚(yú)體上, 指環(huán)蟲(chóng)的產(chǎn)卵一般分為兩種情況, 一種是產(chǎn)卵季節(jié)性很強(qiáng), 只在某特定時(shí)期產(chǎn)卵, 由于事先積累大量卵, 因此產(chǎn)卵的速率很快; 另外一種情況是產(chǎn)卵季節(jié)性弱, 卵一經(jīng)形成即產(chǎn)出, 產(chǎn)卵速率較慢、較穩(wěn)定, 易受溫度影響[16]。在本實(shí)驗(yàn)中, 成熟的中型指環(huán)蟲(chóng)蟲(chóng)體內(nèi)只存在一枚蟲(chóng)卵, 并沒(méi)有積累多枚卵, 產(chǎn)卵類(lèi)型類(lèi)似于后者。

指環(huán)蟲(chóng)的產(chǎn)卵速率與溫度密切相關(guān), 在10、22、30、35℃溫度下, 中型指環(huán)蟲(chóng)的產(chǎn)卵維持的時(shí)間分別為4d、23h、15h和11h, 即產(chǎn)卵速率隨著溫度的升高而加快。當(dāng)溫度從 5℃升高到 18℃時(shí), 單殖吸蟲(chóng)Discocotyle sagittata的產(chǎn)卵速率從 1.5枚/(蟲(chóng)?d)上升到 12枚/(蟲(chóng)?d)[17]; 當(dāng)溫度從 10℃升到20℃時(shí),單殖吸蟲(chóng)Neoheterobothrium hirame的產(chǎn)卵速率也由 8.5 枚/(蟲(chóng)?h)上升到 32.55 枚/(蟲(chóng)?h)[18]?？梢?jiàn), 在一定溫度范圍內(nèi), 隨著溫度升高, 單殖吸蟲(chóng)的產(chǎn)卵速率也隨著加快。

圖5 不同溫度條件下中型指環(huán)蟲(chóng)蟲(chóng)卵的孵化率(n代表蟲(chóng)卵的數(shù)量)Fig.5 Hatching rate of D.intermedius at 10℃, 22℃, 30℃ and 35℃(n represents the number of eggs)

3.2 溫度對(duì)產(chǎn)卵量的影響

單殖吸蟲(chóng)的產(chǎn)卵量也受到溫度的影響。在 4℃條件下, 中型指環(huán)蟲(chóng)基本上不產(chǎn)卵, 當(dāng)溫度從 10℃升到 35℃, 中型指環(huán)蟲(chóng)的平均產(chǎn)卵量從 3.30枚/蟲(chóng)上升至 4.24枚/蟲(chóng), 且 35℃條件下的平均產(chǎn)卵量顯著高于10℃的。秉偽指環(huán)蟲(chóng)(Pseudodactylogyrus bini)在 24h內(nèi)的平均產(chǎn)卵量在 30℃最高, 在 5℃條件下秉偽指環(huán)蟲(chóng)基本上不產(chǎn)卵[19]。在 17.5℃條件下, 本尼登蟲(chóng)(Benedenia seriolae)和軛聯(lián)蟲(chóng)(Zeuxapta seriolae)的平均產(chǎn)量均達(dá)到最高, 分別為61.4枚/蟲(chóng)和309.3枚/蟲(chóng)[12]。在14℃條件下, 小鞘指環(huán)蟲(chóng)(Dactylogyrus vaginalatus)的產(chǎn)卵量最大, 低于或高于此溫度, 產(chǎn)卵量均下降[20]。不同的單殖吸蟲(chóng)種類(lèi), 其產(chǎn)卵量達(dá)到最大值的溫度各不相同, 與小鞘指環(huán)蟲(chóng)、秉偽指環(huán)蟲(chóng)、本尼登蟲(chóng)和軛聯(lián)蟲(chóng)相比, 中型指環(huán)蟲(chóng)產(chǎn)卵量達(dá)到最大值的溫度更高。

3.3 溫度對(duì)孵化速率和孵化率的影響

同樣, 溫度對(duì)蟲(chóng)卵的孵化速率和孵化率也都有較大的影響。在4℃條件下, 中型指環(huán)蟲(chóng)蟲(chóng)卵不能孵化, 在 10—35℃的溫度范圍內(nèi), 蟲(chóng)卵的孵化速率不斷增加, 孵化率卻在 22℃最高。在 15℃、20℃和 23℃三個(gè)溫度條件下, 河鱸錨首吸蟲(chóng)(Ancyrocephalus mogurndae)的孵化速率隨著溫度的升高而加快, 而孵化率卻在15℃時(shí)最高[21]。在13—21℃范圍內(nèi), 本尼登蟲(chóng)蟲(chóng)卵的孵化率無(wú)明顯差異, 均在 0.73—0.78;而軛聯(lián)蟲(chóng)的蟲(chóng)卵在13℃下的孵化率要明顯低于17.5℃和 21℃[12]。單殖吸蟲(chóng)Bivagina tai[22]和Neoheterobothrium hirame[23]的蟲(chóng)卵在高溫條件下(30℃)孵化率均下降。秉偽指環(huán)蟲(chóng)的蟲(chóng)卵在34℃條件下可以發(fā)育, 但是卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)成功孵化, 且在 37℃條件下其蟲(chóng)卵的發(fā)育和孵化完全受到抑制[19]?？梢?jiàn), 單殖吸蟲(chóng)的孵化速率達(dá)到最大值時(shí)的溫度往往高于孵化率達(dá)到最高值時(shí)的溫度, 也就是說(shuō), 孵化速率達(dá)到最大值時(shí)的溫度并不一定是最適的孵化溫度。在35℃的高溫條件下, 中型指環(huán)蟲(chóng)的蟲(chóng)卵還能成功孵化,孵化速率也是最快的, 但是孵化率卻降低, 說(shuō)明此溫度已經(jīng)對(duì)蟲(chóng)卵孵化產(chǎn)生一定的抑制作用。另外,本研究還發(fā)現(xiàn)在4℃低溫保存7d后的蟲(chóng)卵仍能再成功孵化, 且孵化率沒(méi)有明顯降低。但是低溫(5℃)處理Diplectanum aequans的蟲(chóng)卵后, 在室溫(18℃)條件下的孵化率卻顯著降低[24]?？梢?jiàn), 溫度對(duì)不同種類(lèi)單殖吸蟲(chóng)的產(chǎn)卵、孵化等產(chǎn)生不同程度的影響。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果, 可以初步得出, 當(dāng)水溫為22℃時(shí), 中型指環(huán)蟲(chóng)的產(chǎn)卵數(shù)量和纖毛幼蟲(chóng)的存活時(shí)間都比較高, 且孵化率最高, 表明在該溫度條件下, 中型指環(huán)蟲(chóng)種群增長(zhǎng)迅速, 容易引起指環(huán)蟲(chóng)病的暴發(fā)和流行。

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