幾丁質(zhì)廢物的轉(zhuǎn)化和利用：蜂房芽孢桿菌B-91幾丁質(zhì)酶的合成條件

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蜂房芽孢桿菌B-91幾丁質(zhì)酶的合成條件

鄭志成 周美英 姚炳新

摘要：從廈門地區(qū)牡蠣養(yǎng)殖場分離篩選到一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力較高的蜂房芽孢桿菌(Bacil -lus alvei)B-91 , 研究了該菌幾丁質(zhì)酶的合成條件。結(jié)果表明：該菌在以幾丁質(zhì)為碳氮源的培養(yǎng)基中生長，能合成多量的幾丁質(zhì)酶。酶的合成受各種幾丁質(zhì)誘導(dǎo)。在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加不同的有機或無機氮源，均能促進酶的合成，而葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖對酶合成有阻遏作用。該菌幾丁質(zhì)酶合成的最適培養(yǎng)基初始pH為6.8，最適溫度為28.C。在250ml三角瓶裝50ml培養(yǎng)基，接種量為2%，振蕩培養(yǎng)60h時，培養(yǎng)液中幾丁質(zhì)酶活力可達2212u/mL。

關(guān)鍵詞：蜂房芽孢桿菌，幾丁質(zhì)酶，合成條件

幾丁質(zhì)是自然界中除纖維素外貯量最大的生物多聚糖。幾丁質(zhì)酶( Chitihanse，EC3.4.1.14)可催化水解幾丁質(zhì)的β-1.4糖苷鍵生成N-乙酞氨基葡萄糖(N-acetylglcosamine，NAG)，因此在蟹、蝦殼等幾丁質(zhì)廢物的轉(zhuǎn)化和利用方面有重要作用。國外對微生物幾丁質(zhì)酶進行了許多研究，包括產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的微生物、酶的特性及酶的分子生物學等。近年來對幾丁質(zhì)酶采用基因重組技術(shù)， 獲得了具有抗真菌、線蟲、昆蟲和其它病原體的轉(zhuǎn)基因植物，但迄今未見有關(guān)蜂房芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶合成條件的研究報道。為了開發(fā)利用幾丁質(zhì)酶，我們從分離到100余株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細菌中，選出一株幾丁質(zhì)酶活力較高的蜂房芽孢桿菌B-91，研究該菌株幾丁質(zhì)酶的合成條件。本文報道這研究結(jié)果。

1 材料與方法

菌株：B-91菌株為本實驗室從廈門地區(qū)牡蠣養(yǎng)殖場灘涂分離篩選得到，經(jīng)分類鑒定該菌株為芽孢桿菌屬的蜂房芽孢桿菌(Bacillus alvei)。

培養(yǎng)基:

l)斜面培養(yǎng)基(%)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，葡萄糖0.5，K2Hpo4(西南漁業(yè)網(wǎng)注：磷酸氫二鉀)0.1，Na2HPO4(西南漁業(yè)網(wǎng)注：磷酸氫二鈉)0.2，MgSO4?7H2O(西南漁業(yè)網(wǎng)注：七水硫酸鎂)0.05，NaCI(西南漁業(yè)網(wǎng)注：氯化鈉)0.5，KCI(西南漁業(yè)網(wǎng)注：鉀鹽)0.05，瓊脂1.8，pH7.2；

2)種子培養(yǎng)基：除不加瓊脂外，其它成分同斜面培養(yǎng)基；

3)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(%)：KH2po4(西南漁業(yè)網(wǎng)注：磷酸氫二鉀)0.1，Na2HPO4(西南漁業(yè)網(wǎng)注：磷酸氫二鈉)0.2，MgSO4?7H2O(西南漁業(yè)網(wǎng)注：七水硫酸鎂)0.05，KCI(西南漁業(yè)網(wǎng)注：鉀鹽)0.05，pH6.8；

4)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加人2.0%幾丁質(zhì)即為產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

幾丁質(zhì)預(yù)處理：試驗用幾丁質(zhì)(江蘇農(nóng)學院出品)、脫礦質(zhì)幾丁質(zhì)和脫乙酰幾丁質(zhì)(由國家海洋局第三海洋研究所提供)均經(jīng)研碎，過150目篩。膠體幾丁質(zhì)則是由幾丁質(zhì)經(jīng)濃HCI處理，離心后上清液于蒸餾水中沉淀而成。蠶蛹殼粉和蝦殼粉分別由蠶蛹殼和蝦殼經(jīng)洗凈、干燥、磨碎過篩而成。上述幾丁質(zhì)均經(jīng)單獨滅菌，于接種時與培養(yǎng)基的其它成分混合。

培養(yǎng)條件：取經(jīng)28.C培養(yǎng)48h的斜面菌種一環(huán)，接入種子培養(yǎng)基，于28.C旋轉(zhuǎn)(2OOr/min)搖床振蕩培養(yǎng)24h后，按2%接種量將種子液接入試驗的培養(yǎng)基中，置同一搖床振蕩培養(yǎng)。除另有說明外，產(chǎn)酶試驗的培養(yǎng)溫度均為28.C，培養(yǎng)時間為60h，培養(yǎng)基裝量為25OmL三角瓶裝50mL培養(yǎng)基。

酶活力測定：培養(yǎng)液經(jīng)8000r/min離心10mln，上清液即為粗酶液。取此粗酶液1mL，加人到含5.0mg膠體幾丁質(zhì)的檸檬酸緩沖液(pH5.0)1ml中，40.C保溫振蕩1h，流水冷卻，4000r/min離心10 mim，取上清液測定NAG(西南漁業(yè)網(wǎng)注：乙酰氨基葡萄糖苷酶)量，并以蒸餾水代替膠體幾丁質(zhì)，按上法測定作為空白對照，NAG量按Johnson的改良法測定，一個酶活力單位定義為在上述條件下產(chǎn)生1ugNAG的酶量。

生物量測定：取經(jīng)20倍稀釋的培養(yǎng)液，以未接種等倍稀釋的培養(yǎng)基作為對照，在721分光光度計620nm處測定光吸收值。

2 結(jié)果與討論

2.1氮源對酶合成的影響

以產(chǎn)酶培養(yǎng)基作對照，在該培養(yǎng)基(初始pH均為6.8)中添加不同氮源，振蕩培養(yǎng)后分別測定培養(yǎng)液酶活力。結(jié)果(表1)表明，添加的10種有機和無機氮源均能促進酶的合成。有機氮源以酵母膏和酪蛋白的酶活力最高，分別比對照高96.2%和85.4%，其次為牛肉膏和玉米漿，而蛋白胨和黃豆粉對酶合成也有一定的促進作用。無機氮源以NH4NO3(西南漁業(yè)網(wǎng)注：硝酸銨)和(NH4)2SO4(西南漁業(yè)網(wǎng)注：硫酸銨)的酶活力最高，分別比對照高108.7和102.1%，而NH4CI(西南漁業(yè)網(wǎng)注：氯化銨)和NaNO3(西南漁業(yè)網(wǎng)注：硝酸鈉)對酶的合成也有較好的促進作用。

2.2 碳源對酶合成的影響

在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加濃度為2.0%的不同碳源，產(chǎn)酶試驗結(jié)果(表2)表明，在添加的5種碳源中除淀粉提高了培養(yǎng)液的酶活力外，其它碳源均使酶活力顯著下降，而以添加葡萄糖的培養(yǎng)液酶活力最低，說明這4種糖對該菌株幾丁質(zhì)酶合成有阻遏作用。這個結(jié)果與文獻報道一致。

2.3 酶合成的誘導(dǎo)特性

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對照，在該培養(yǎng)基中分別加人不同的幾丁質(zhì)或含幾丁質(zhì)的物質(zhì)作為酶合成誘導(dǎo)物，酶活力測定結(jié)果(表3)表明， 蜂房芽孢桿菌B-91在含有幾個質(zhì)作為唯一碳氮源培養(yǎng)基中才能合成幾丁質(zhì)酶，這與文獻報道對Stre ptom yces，as-pergillus和Myrothecium的研究結(jié)果一致。但Neugebauer曾報道Stre ptom yces TK24產(chǎn)幾丁質(zhì)酶為幾丁質(zhì)所誘導(dǎo)，而在沒有幾丁質(zhì)存在的培養(yǎng)基中也能產(chǎn)生少量的幾丁質(zhì)酶。這可能是由于使用的微生物菌種或菌株特性不同所致，在添加幾丁質(zhì)濃度為2.0%時，這些物質(zhì)均能誘導(dǎo)合成較高活力的幾丁質(zhì)酶，其中以蠶蛹殼粉、幾丁質(zhì)和蝦殼粉效果最佳, 而脫礦質(zhì)幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)和脫乙酰幾丁質(zhì)也有較好的誘導(dǎo)作用。說明該菌株幾丁質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶。幾丁質(zhì)和含有幾丁質(zhì)的物質(zhì)是該菌幾丁質(zhì)酶合成的良好誘導(dǎo)物，而幾丁質(zhì)單糖(NAG)則不能誘導(dǎo)該酶的合成。從蠶蛹殼粉和蝦殼粉強烈誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶合成的發(fā)現(xiàn)，說明它們可作為幾丁質(zhì)酶生產(chǎn)的良好原料，這將為這些原料的開發(fā)利用提供了新的途徑。采用不同濃度(1.0%一4.0%)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)試驗結(jié)果表明，添加幾丁質(zhì)的適宜濃度為2.0%高于這個濃度酶活力并沒有提高。

2.4 培養(yǎng)時間對酶合成的影響

取經(jīng)培養(yǎng)24h的種子液，按2%接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，28.C振蕩培養(yǎng)至96h，定時取樣分別測定生物量和酶活力。結(jié)果(圖1)表明，該菌在培養(yǎng)24h至48h處于對數(shù)生長期，與此同時幾丁質(zhì)酶活力也急速提高。當培養(yǎng)60-84h時，菌生長處于穩(wěn)定期，酶活力達到最高值。隨著培養(yǎng)時間的延長，芽抱大量形成，酶活力也出現(xiàn)下降趨勢。這些結(jié)果說明該菌菌體生長與幾丁質(zhì)酶合成是基本同步的，產(chǎn)酶最適培養(yǎng)時間為60h。

2.5 培養(yǎng)基初始pH對酶合成的影響

將產(chǎn)酶培養(yǎng)基調(diào)至不同pH，進行產(chǎn)酶產(chǎn)酶試驗。結(jié)果(圖2)表明，當培養(yǎng)基初始pH為6.8時，該菌培養(yǎng)液幾丁質(zhì)酶活力達最高值，pH低于6.4或高于7.0時，酶活力降低。

2.6 培養(yǎng)溫度對酶合成的影響

培養(yǎng)溫度對酶合成影響的試驗是在22-36.C的梯度搖床上培養(yǎng)60h，測定培養(yǎng)液酶活力(圖2)。在26-30.C之間，酶活力都較高。培養(yǎng)溫度以28.C為宜。

2.7 通氣量對酶合成的影響

采用250mL三角瓶，分別加入30、40、50、60、70、80、90mL培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)后，分別加水到原來的體積，測定酶活力。結(jié)果( 圖2)表明，在250mL三角瓶中加人40-70mL培養(yǎng)基的酶活力均比較高，培養(yǎng)基裝量超出此范圍，酶活力有所降低，說明通氣量對蜂房芽孢桿菌B-91幾丁質(zhì)酶合成影響小，這一特點對利用該菌進行幾丁質(zhì)酶生產(chǎn)是有利的。

參考文獻

略

(本文來源：廈門大學學報(自然科學版)，1995年5月，第34卷第3期)

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