藥敏實驗在魚病防治中的實際應(yīng)用

摘 要： 隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖精養(yǎng)程度的提高，水環(huán)境惡化和濫用抗生素等多方面原因，細菌性漁病頻發(fā)，且呈現(xiàn)出發(fā)病快、來勢猛，高死亡率的特點，給漁民造成了巨大的經(jīng)濟損失。筆者設(shè)計了一種以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的快速藥敏試驗（K-B法）方法，旨在指導(dǎo)漁民準(zhǔn)確、及時的對癥用藥，盡可能減少經(jīng)濟損失；通過反復(fù)實踐證明，應(yīng)用該方法一般快則能在4-5h出試驗結(jié)果，慢則7-9h出試驗結(jié)果，且試驗重復(fù)性好，適合于基層推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：細菌性疾病 藥敏試驗 K-B法 LB培養(yǎng)基 快速

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖密度過大、環(huán)境惡化和其它多種原因?qū)е录毦约膊∪找嬖龆?。近幾年來，由于養(yǎng)殖戶忽略對疾病的正確認(rèn)識而盲目濫用抗生素，包括用藥不當(dāng)和劑量不準(zhǔn)確等情況，增加了細菌的耐藥性，使得抗菌藥對細菌性疾病的控制效果越來越差，不但造成藥物浪費，更為嚴(yán)重的還延誤病情。也有一些養(yǎng)殖人員能對疾病做出正確診斷，但在對癥下藥時卻很難憑經(jīng)驗做出判斷，在這種情況下，對致病菌做藥敏試驗是最科學(xué)的方法。但是如果按照傳統(tǒng)方法進行細菌鑒定和藥敏試驗，需要很長時間，尤其是細菌鑒定從一開始的細菌分離到最后的動物回歸確診，至少需1周～2周時間，但對農(nóng)戶來說一旦魚發(fā)病了，時間是很寶貴的，早用一天藥就減少一天的損失。

測定抗菌藥物在體外對微生物有無抵制作用的方法稱為藥物敏感性實驗，簡稱藥敏實驗。K-B法，即我們通常所說的紙片擴散藥敏試驗，是目前臨床上最常用的藥敏試驗方法。其具備技術(shù)上簡單易行，重復(fù)性好；試驗成本相對較低，不需任何特殊設(shè)備；抗菌藥物的選擇有很大的靈活性；藥敏結(jié)果解釋性分類（S 、I 、R）易理解等特點[1]。經(jīng)典的藥敏試驗選擇的是M-H培養(yǎng)基 [1]，也有選擇肉膏-胰胨培養(yǎng)基[2]，而關(guān)于LB培養(yǎng)基應(yīng)用于藥敏試驗鮮有報告。本文以安徽省滁州市某水庫發(fā)病的鳊魚為例，就LB培養(yǎng)基應(yīng)用于藥敏試驗（K-B法）做一探討。

材料與方法：

1.1 材料

1.1.1 LB液體培養(yǎng)基[3]：蛋白胨1%，酵母膏1%，氯化鈉0.5%，PH 7.2；121℃20min。 LB固體培養(yǎng)基：是在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5-2.0%的瓊脂, 121℃20min。

1.1.2 藥敏試紙（購自杭州微生物公司）

1.1.3 0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度[1]：將0.5ML0.048mol/l的BaCl2(1.175% w/vBaCl2·2H2O) 加入到99.5ml0.18mol/l的H2SO4（1%W/V）中并不斷攪動，以維持混懸狀態(tài)。

1.1.4 TTC溶液：0.4%TTC水溶液121℃20min滅菌備用。

1.1.5 病魚：取自安徽省滁州市某水庫急性發(fā)病的鳊魚。

1.2 方法

1.2.1 藥敏平板的制作

1.2.1.1 LB藥敏平板：

將滅過菌的LB固體培養(yǎng)基在無菌操作臺中當(dāng)培養(yǎng)基冷到60℃左右時，倒平板（90mm培養(yǎng)皿，每皿注入培養(yǎng)基約20 ml）晾干備用。

1.2.1.2 TTC顯色藥敏平板：

將滅過菌的LB固體培養(yǎng)基在無菌操作臺中當(dāng)培養(yǎng)基冷到60℃左右時，加入0.4% TTC水溶液0.6ml/100ml(使TTC濃度為0.0024%)與培養(yǎng)基混合均勻，然后倒平皿（90mm培養(yǎng)皿，每皿注入培養(yǎng)基約20 ml）晾干備用。

1.2.2 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管的制作[1]

將0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度液的的正確濃度應(yīng)光徑為1cm，并配有合適比色杯的分光光度計來核實，0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)在625nm處的吸光度值應(yīng)為0.08-0.1；按每管4-6ml將硫酸鋇懸液分裝于帶旋蓋的管子中，管子的大小應(yīng)與培養(yǎng)或稀釋接種菌所用的管子一致，標(biāo)準(zhǔn)濁度管應(yīng)密封并貯存于室溫暗處，使用前宜于旋轉(zhuǎn)混勻器上劇烈震蕩，目測其外觀濁度應(yīng)均勻一致。

1.2.3 K-B紙片法的具體步驟為[1]：

用醫(yī)用棉鑒（滅菌）將麥?zhǔn)媳葷岫葹?.5的受試菌液(或病變組織勻漿液)0.2ml均勻涂布于含有TTC的LB瓊脂平皿表面（均勻涂抹3次，每次涂抹時轉(zhuǎn)動角度60°,注意不要將瓊脂劃破），待菌液被完全吸收后,將同一批次的含有一定濃度抗菌藥物的含藥紙片均勻貼于已接種菌液的LB瓊脂平板表面（各藥片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm.見圖示1），36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4-9h，直至抑菌圈清晰為止，用游標(biāo)卡尺或直尺量取受試菌的抑菌圈直徑，然后與參考標(biāo)準(zhǔn)進行比較來判定受試菌的藥敏結(jié)果。

直接藥敏試驗（又稱一步法藥敏試驗）[4]：

用70%的酒精棉球擦拭病魚體表，用消毒過的解剖剪，分別取肝臟和腎臟等組織勻漿液0.2ml涂藥敏平板，按K-B紙片法的具體步驟做藥驗試驗。

1.2.5 富集培養(yǎng)藥敏法（增菌培養(yǎng)后再作藥敏）：

將鳊魚病變的腎臟與肝臟組織勻漿液接種到裝有LB液體培養(yǎng)基的試管或離心管中，36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-9h進行增菌培養(yǎng)后做藥敏試驗。

1.2.6 致病菌純培養(yǎng)后的藥敏情況：

通過稀釋法，將純培養(yǎng)后致病菌液的濃度調(diào)整到0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛龋毦鷿舛燃s為1.5億/ML）;取0.2ml涂藥敏平板，按K-B紙片法的具體步驟做藥驗試驗。

2、試驗結(jié)果：

2.1直接法藥敏試驗結(jié)果:

表1、直接法藥敏試驗結(jié)果

2.2富集法培養(yǎng)藥敏試驗結(jié)果

表2、富集法培養(yǎng)藥敏結(jié)果

2.3致病菌純培養(yǎng)后藥敏結(jié)果

表3、致病菌純培養(yǎng)后藥敏結(jié)果

2.4 根據(jù)抑菌圈試驗結(jié)果，并具體針對不同的抗生素、菌株參考NCCLS標(biāo)準(zhǔn)或CSLI標(biāo)準(zhǔn)，做出判斷。

小結(jié)：試驗證明藥敏試紙環(huán)丙氟派酸、諾氟沙星、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、痢特靈敏感度最高，但環(huán)丙氟派酸、紅霉素屬于禁止用漁藥，可選擇其他幾種藥物使用。實踐選用了推薦藥物中的諾氟沙星拌料投喂后兩天便控制了病情,效果顯著！

3、討論：

3.1 不同TTC濃度對結(jié)果的影響：筆者在用顯色藥敏平板前曾做過預(yù)試驗使其培養(yǎng)基中TTC的濃度分別為0、0.0008%、0.0016%、0.0024%、0.0032%、0.0040%、0.0048%，發(fā)現(xiàn)0.0024%效果最明顯，既可使著色菌落染成明顯紅色，又可保證菌落數(shù)與對照（不加TTC）平皿菌落數(shù)相接近[5]，而0.0032%、0.0040%、0.0048%有抑制作用。

3.2 通過用直接法藥敏試驗和富集法培養(yǎng)藥敏試驗、致病菌純培養(yǎng)后藥敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種方法試驗結(jié)果無差異，以后在實踐中可根據(jù)需要靈活運用。

4 、思考

細菌耐藥速度的快速增長是當(dāng)今社會的一大難題, 預(yù)防因盲目用藥引起的耐藥菌株的產(chǎn)生, 配合臨床盡快準(zhǔn)確用藥, 降低漁業(yè)生產(chǎn)損失，實驗室的快速藥敏報告顯得尤為重要！此項技術(shù)簡單易行，不需要特殊的儀器設(shè)備，重復(fù)性好[1]！特建議為魚病室常規(guī)檢測，這將針對性指導(dǎo)漁業(yè)生產(chǎn)用藥，降低生產(chǎn)用藥成本與預(yù)防由于亂用藥而導(dǎo)致的抗藥性，將起到重要作用，是目前魚病防治比較快速、有效的方法，應(yīng)該積極的推廣的生產(chǎn)當(dāng)中去。

(來源: 江西水產(chǎn)科技2014,(2)期)